脆性X智力低下基因有什么研究
檢測(cè)脆性X染色體綜合征智力低下基因FMR1中(CGG)n拷貝數(shù)的多態(tài)性。下面小編為你整理脆性X智力低下基因FMR1中不穩(wěn)定DNA序列的研究,希望能幫到你。
【摘要】 目的 檢測(cè)脆性X染色體綜合征智力低下基因FMR1中(CGG)n拷貝數(shù)的多態(tài)性。 方法 采用PCR結(jié)合序列膠銀染法、Southern blot雜交分析法,對(duì)299條表型正常的湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)(CGG)n拷貝數(shù)的多態(tài)性及分布頻率進(jìn)行了測(cè)定和驗(yàn)證。 結(jié)果 顯示其范圍為20~40,高峰為28,PCR-序列分析銀染法結(jié)果與Southern blot法結(jié)果完全一致。 結(jié)論 檢測(cè)了湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)(CGG)n拷貝數(shù)的多態(tài)性;運(yùn)用PCR-序列分析膠銀染法快速、直接、簡(jiǎn)便、實(shí)用,適合脆性X綜合征的大規(guī)模群體篩查。
【關(guān)鍵詞】 脆性X綜合征 FMR1 (CGG)n PCR
脆性X綜合征(fragile X syndrome,F(xiàn)raX)是常見的遺傳性智力低下性疾病之一,其發(fā)病率僅次于唐氏綜合征。在人群中男性的發(fā)病率約為1/4000 [1] ,女性的發(fā)病率為1/2500 [2] 。其在細(xì)胞學(xué)上主要表現(xiàn)為Xq27.3帶處有一細(xì)絲樣的脆性位點(diǎn)(FRAXA) [3] ,在分子水平上表現(xiàn)為FMR1基因5'端(CGG)n的異常擴(kuò)增。(CGG)n在正常人群體中呈多態(tài)性,n=6-50,當(dāng)n=50-200時(shí)為前突變,n>200時(shí)為全突變,同時(shí)伴隨其周圍CpG島異常甲基化 [4] 。我們根據(jù)FraX基因致病特點(diǎn),通過(guò)測(cè)定湖南省人群中CGG重復(fù)序列,了解其分布的多態(tài)性,并建立一個(gè)簡(jiǎn)便、快捷的基因檢測(cè)方法。
1 材料和方法
1.1 研究對(duì)象及標(biāo)本 208名人群為本校附屬醫(yī)院門診自愿受檢者,男117名,女91名,年齡24~56歲,平均36.5歲。分別從肘靜脈抽取血1~2ml,以草酸鉀抗凝,標(biāo)本按碘化鉀法提取DNA。
1.2 主要試劑 T 4 多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均為NEB公司產(chǎn)品,雜交液、尼龍膜、PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑均購(gòu)自上海生工,探針PE5.1由美國(guó)紐約州立發(fā)育不全基礎(chǔ)研究所Nanbert Zhong博士惠贈(zèng)。
1.3 PCR擴(kuò)增 PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn) [5] ,在FMR1基因內(nèi)(CGG)n重復(fù)區(qū)域兩側(cè)合成引物。其中上游引物為:5'-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3',下游引物為:5'-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3'。反應(yīng)體積為20μl,其中包括10×PCR緩沖液,50~100ng模板,每種引物5pmol,200μmol/LdNTP,其中dGTP中75%為7-deaza-dGTP,10%DMSO,1UTaq DNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min,95℃1min,65℃1min,72℃2min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。
1.4 PCR產(chǎn)物的序列膠銀染法檢測(cè) 取10μl PCR產(chǎn)物加入載樣緩沖液于6%序列膠電泳。電泳畢經(jīng)乙酸固定、Ag-NO3溶液染色及Na 2 CO 3 顯示后觀察結(jié)果。
1.5 Southern印跡雜交 取5μl PCR產(chǎn)物于6%序列膠電泳,常規(guī)電轉(zhuǎn)膜,用5′末端標(biāo)記法以γ- 32 P-ATP標(biāo)記探針PE5.1,經(jīng)預(yù)雜交4h,雜交2h,充分洗膜后常規(guī)壓片,-70℃放射自顯影。
2 結(jié)果
2.1 湖南省人群中FRAXA位點(diǎn)(CGG)n的多態(tài)性及分布頻率用PCR方法分析了299條X染色體。經(jīng)序列膠測(cè)定(圖2),Southern印跡雜交法驗(yàn)證(圖3),表明(CGG)n的拷貝數(shù)在20~40之間(見表1),頻率最高的為28(圖1)。
表1 湖南省人群中299條X染色體的CGG重復(fù)數(shù) CGG重復(fù)數(shù) 等位基因數(shù) 構(gòu)成比(略)
圖1 299條X染色體的(CGG) n 多態(tài)性分布圖 2.2 6%序列膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 見圖2。
2.3 Southern blot檢測(cè)PCR產(chǎn)物 Southern印跡雜交結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)帶所在位置與圖2完全一致(見圖3)。
3 討論
3.1 湖南省人群中FRAXA位點(diǎn)(CGG)n的多態(tài)性 299條M:PBR322/MSPI;1,2,3,4,5,6分別表示CGG重復(fù)數(shù)為28,28,31,28,28,29第1,6道為正常女性,第2,3,4,5道為正常 男性(下同)。
圖2 6%序列膠電泳
圖3 Southern印跡雜交
表型正常的湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)(CGG)n測(cè)定結(jié)果顯示,其拷貝數(shù)范圍為20~40,高峰為28,占被檢總數(shù)的64.88%。Hofstee [6] 等報(bào)道的(CGG)n峰值為28,Jacobs [7] 等研究發(fā)現(xiàn)有2個(gè)高峰,即:19~23和28~31。本文結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符,但未見到明顯的終端重復(fù)數(shù),說(shuō)明選取樣本有限。
3.2 PCR-序列分析膠銀染法的運(yùn)用 目前已有多種篩查及診斷FraX的方法,但不同方法各有其局限性。如細(xì)胞遺傳學(xué)分析雖可以直接觀察染色體脆性位點(diǎn)的病變,但此方法檢出率較低;DNA連鎖分析較細(xì)胞遺傳學(xué)分析增加了可信度,但該技術(shù)需要有先證者,致使檢測(cè)受到一定程度的限制;經(jīng)典的Southern blot法雖然準(zhǔn)確性很高,但需要用同位素來(lái)標(biāo)記,給操作者帶來(lái)了一定的危害,并且操作繁雜,費(fèi)用昂貴,耗時(shí)長(zhǎng);常規(guī)的PCR法雖簡(jiǎn)便,但因無(wú)法打開CG含量高的DNA模板導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。因此,探索出一個(gè)穩(wěn)定、快速、適合大規(guī)模人群篩查FraX的方法具有重要的意義。我們通過(guò)用7-deaza-dGTP代替dGTP的改良以降低Tm值,對(duì)299條X染色體的FRAXA位點(diǎn)(CGG)n進(jìn)行了擴(kuò)增,取得了較好的效果。檢測(cè)結(jié)果顯示湖南省人群的高峰為28,而且PCR序列膠銀染法與PCR-Southern blot法結(jié)果完全一致。因此。該方法對(duì)FRAXA的大量群體篩查具有重要的意義。
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