rna干擾技術(shù)論文

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RNA干擾——理論發(fā)展和應用展望篇一

摘要

RNA干擾以及基因沉默是目前分子生物學的一個熱門的研究領(lǐng)域，對于基因工程和醫(yī)藥研究的發(fā)展有著巨大的潛在推動力。RNA干擾通過對mRNA的特異性抑制從而達到高效的基因沉默，已經(jīng)顯示出了其可能帶來醫(yī)療技術(shù)的突破性發(fā)展。本文是對RNA干擾的原理、RNA干擾與基因沉默的理論發(fā)展、其在未來可能的應用發(fā)展進行的簡要綜述。

Abstract

RNA interference (RNAi) and Gene Silence are one of the most favorite research fields in molecular biology, RNAi has great potential in the development of the Genetic Engineering and Medical Research. RNAi can make effective Gene Silence through the specific inhibition on mRNA, so it has shown that it can bring a great breakthrough in medical technology. This essay is a brief review on the theory of RNAi and its developments in theories and applications.

正文

I 概述

RNA干擾(RNAi)主要是指外源性的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)在體內(nèi)引發(fā)的基因沉默(Gene Silence)現(xiàn)象1。RNAi是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silence, PTGS)，其在生物體中是普遍存在的2。

RNAi的作用機制可概括如下：dsRNA進入細胞后，通過ATP依賴性RNA酶III(Dicer, DCR)，變?yōu)楹?1-25bp的siRNA(short-interference RNA);siRNA是引發(fā)核酸酶降解mRNA的引導物，并與AGO(Argonaute)蛋白結(jié)合形成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)，RISC對siRNA解鏈放出反義RNA并與對應的mRNA結(jié)合，使其內(nèi)源性降解;在靶mRNA被降解后，RISC繼續(xù)靶定其他的mRNA。

同時，有些情況下還會產(chǎn)生擴增效應：siRNA或其反義RNA可通過依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase, RdRP)與靶mRNA互補的RNA(cRNA)共同重新合成dsRNA，并通過上述機制生成次級siRNA。通過擴增效應，mRNA的表達會得到完全的抑制，這也是RNAi高效的原因之一。

除了通過siRNA外，在生物體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了另一種RNAi機制：微小RNA(microRNA, miRNA)，1

2 RNA干擾：原理與應用，P.3，湯華，科學出版社，2006 RNA干擾技術(shù)：從基礎(chǔ)科學到藥物開發(fā)，P.3，(美)Appasani K主編，殷勤偉等譯，科學出版社，2007

miRNA是由一種內(nèi)源性發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)DCR加工得到的單鏈RNA，并與AGO蛋白結(jié)合生成miRNA-蛋白復合物(miRNA-protein complex, miRNP)，通過與靶mRNA結(jié)合阻礙其翻譯，達到基因沉默的目的。

(圖1:RNAi的作用機制)3

RNAi理論雖然是從1990年代才開始發(fā)展，但它卻逐漸受到人們的重視。1998年在《Nature》上共同發(fā)表論文4正式提出RNAi理論的Andrew Fire和Craig C Mello 被授予了2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，以表彰他們在基因技術(shù)的使用方面提供了“令人激動的可能性” 、發(fā)現(xiàn)了一種有效中止有缺陷的基因運傳的機制、這為研發(fā)控制這種基因和與疾病作斗爭的新藥提供了可能性。

從RNAi的作用機制中可以看出，由于siRNA或miRNA對mRNA有著特異性的選擇和高效的抑制能力，只要能夠確定所要作用的mRNA或?qū)幕颍涂梢葬槍π缘匾种苖RNA的基因表達，同時也會將其對其他基因表達的影響降至最低。利用這一點，可以發(fā)展很多的治療技術(shù)，用于治療目前難以治療的由RNA病毒所引起的疾病，或者一些由于非人體所需的基因表達所導致的疾病比如癌癥。

RNAi同樣也是一項潛力巨大的基因工程技術(shù)。相比較傳統(tǒng)的基因敲除、轉(zhuǎn)基因以及突變技術(shù)，RNAi更加簡易可行，并可用于較大規(guī)模的基因功能分析，對于基因工程的實驗技術(shù)發(fā)展有著潛在的巨大推動力。

3 Derek MD, Carl DN, Phillip A. Killing the messenger: Short RNAs that silence gene expression. Nature, 2004, 431: 343~349 4 Fire A, Xu S, Montgomery MK. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.

Nature, 1998, 391:806~811

II Dicer酶

2001年，Bernstein從果蠅體內(nèi)分離出一種能夠特異性地切割dsRNA的多蛋白核糖核酸酶，并命名為Dicer(DCR)。Bernstein發(fā)現(xiàn)一種CG4792酶(Dicer-1)可以將dsRNA全部切割成22個堿基長度的RNA片段，他認為這種酶與RNAi有著很大的相關(guān)性5。

DCR的結(jié)構(gòu)中主要包含了三個結(jié)構(gòu)域：以α螺旋為主的RIIIa結(jié)構(gòu)域和RIIIb結(jié)構(gòu)域，以

6及包含α螺旋和β折疊的PAZ結(jié)構(gòu)域。

(圖2：鞭毛蟲的DCR結(jié)構(gòu))7

這三個結(jié)構(gòu)域中RIIIa結(jié)構(gòu)域和RIIIb結(jié)構(gòu)域通過切斷dsRNA中的磷酸二酯鍵來將dsRNA剪切為siRNA，而PAZ結(jié)構(gòu)域則在識別dsRNA時起到關(guān)鍵的作用。

在DCR剪切模型的發(fā)展中，仍存在著不同的看法。一種是Blaszczyk于2001年提出的包含兩個活性中心的DCR模型;另一種是Zhang、Kolb等于2004年提出的包含一個活性中心的DCR模型。

在Blaszczyk模型中，兩個活性中心都與Mg2+或Mn2+配位，由二價金屬離子輔助剪切dsRNA中的兩個磷酸二酯鍵。該模型是建立在對細菌的Aa-RNase III結(jié)構(gòu)域進行X射線晶體結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)之上的，發(fā)現(xiàn)兩個Aa-RNase III可以首尾相連共同剪切一個dsRNA，產(chǎn)生9bp的siRNA產(chǎn)物。8

在Zhang模型中，DCR中只含有一個dsRNA剪切的活性中心，由同一DCR分子中的RIIIa結(jié)構(gòu)域和RIIIb結(jié)構(gòu)域組成。活性中心仍然與Mg2+或Mn2+配位，不過與Blaszczyk模型不同的是，在剪切第二個磷酸二酯鍵時dsRNA會由原位置旋轉(zhuǎn)約30°，由PAZ結(jié)構(gòu)域重新識別后再剪切。9 5 Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 2001, 409: 363~366 6 MacRae IJ, Zhou K, Li F. Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science, 2006, 311:195~198 7 MacRae IJ, Zhou K, Li F. Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science, 2006, 311:196-Fig.2 8 Blaszczyk J, Tropea JE. Crystallographic and Modeling Studies of RNase III Suggest a Mechanism for Double-Stranded RNA Cleavage. Structure, 2001, 9:1225~1236 9 Zhang H, Kolb FA. Single Processing Center Models for Human Dicer and Bacterial RNase III. Cell, 2004,

III RISC

RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)是在RNAi的最后階段中起到剪切降解靶mRNA作用的關(guān)鍵反應物。RISC是由siRNA或miRNA與AGO(Argonaute)蛋白形成的復合體，其組裝經(jīng)由RISC裝載復合體(RISC loading complex, RLC)，使siRNA與AGO蛋白組合。而RISC對靶mRNA的剪切則是通過AGO蛋白的PAZ結(jié)構(gòu)域的識別以及PIWI結(jié)構(gòu)域及剪切完成的。

目前也有研究表明在細胞核中也有RNAi的相關(guān)成分參與了DNA甲基化等反應，其中有與RISC類似的RNA誘導的轉(zhuǎn)錄性基因沉默啟動復合體(RNA-induced transcriptional silencing complex, RITS)的存在11，說明RISC在RNAi中具有重要的地位。

AGO蛋白中的主要活性區(qū)域是PAZ和PIWI。PAZ結(jié)構(gòu)域?qū)τ?′端單鏈結(jié)構(gòu)的單鏈RNA和dsRNA具有強烈的親和作用，因此可以識別siRNA以及mRNA。而在PIWI結(jié)構(gòu)域中具有一個剪切mRNA的活性中心，可以切斷mRNA的磷酸二酯鍵，在這個活性中心處，siRNA與10 MacRae IJ, Zhou K, Li F. Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science, 2006, 311:197-Fig.4 11 Craig C. Mello, Darryl Conte Jr. Revealing the world of RNA interference.

mRNA互補配對。

RISC的組裝模型至今沒有定論，不過基本上都是通過RLC中間復合體進行的，RLC是由剪切dsRNA的DCR和siRNA/miRNA與AGO蛋白結(jié)合的中間體，再解離出DCR和RISC。在不同的生物體中，組裝的模式和參與組裝的底物也不同。 12 Elkayam E, Greene EM. The Structure of Human Argonaute-2 in Complex with miR-20a.

2004年，Song在研究激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)AGO蛋白晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上提出了一種可能的RISC剪切模型。他發(fā)現(xiàn)在AGO蛋白中PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域中有可能容納底物的溝槽狀結(jié)構(gòu)，PAZ和PIWI分別位于這個溝的兩側(cè)，Song推測PAZ識別siRNA后會誘導siRNA以及與其互補的靶mRNA進入溝，并在PIWI的活性中心處將靶mRNA的磷酸二酯鍵切斷，達到抑制靶mRNA表達的作用。

1414 Tang G. siRNA and miRNA: an insight into RISCs. TRENDS in Biochemical Science, 2005, 30:106~114 Song JJ, Smith SK, Hannon GJ. Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for RISC Slicer Activity.

IV RdRP

依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase, RdRP)普遍存在于真菌、植物以及線蟲中，對于這些生物體中的RNAi是必須的，RdRP可以以siRNA為底物合成新的dsRNA。

一種典型的RdRP的結(jié)構(gòu)圖，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中主要是α螺旋結(jié)構(gòu)。RdRP的作用是將游離的siRNA與靶mRNA結(jié)合，并以此為模板聚合成新的dsRNA。而新的dsRNA再通過DCR剪切形成siRNA(次級siRNA)，次級siRNA又可以通過RdRP再一次進行該反應，因此可以通過這種擴增機制產(chǎn)生大量的siRNA，使得靶mRNA得到完全抑制。

這里值得注意的一點是，由于RdRP用siRNA和靶mRNA為模板，而siRNA的長度明顯小于靶mRNA，因此合成的dsRNA被DCR剪切形成的次級siRNA不僅僅是原siRNA，還會包含原siRNA的上游序列或者下游序列。這些次級siRNA所靶定的mRNA的區(qū)域可能并非原來所期望的區(qū)域，因此產(chǎn)生了過渡性RNAi(transitive RNAi)。不過，所有的次級siRNA所抑制降解的仍是原靶mRNA，因此過渡性RNAi并不會使RNAi發(fā)生錯誤。

V RNAi在醫(yī)療中的應用

由于RNAi在疾病預防和治療領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大潛力，從這一現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)開始，就不斷有大量的研究將RNAi應用于醫(yī)療，雖然RNAi仍然是一個比較新的領(lǐng)域，但是其在醫(yī)療方面的應用已經(jīng)出現(xiàn)了不少令人期待的成果。

目前RNAi已被應用于HIV病毒的預防的治療，在2008年，Priti Kumar在《Cell》上發(fā)表論文稱觀察到細胞外導入的siRNA可以有效地抑制HIV-1病毒對T細胞的感染17。

2002年，Lassus等人用RNAi技術(shù)分別沉默了Caspase-1和Caspase-2的基因表達，發(fā)現(xiàn)Caspase-2蛋白質(zhì)水平降低后可以降低由于藥物造成DNA損傷導致的細胞凋亡18。由于細胞凋亡與器官功能衰退以及惡性腫瘤的形成有著密切的聯(lián)系，因此RNAi技術(shù)也有望應用于治療器官衰竭和惡性腫瘤。

VI RNAi在基因工程中的應用

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種在細胞基因組水平發(fā)揮作用的dsRNA介導途徑，分別為RNA指導的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)、RNAi介導的異染色質(zhì)的形成、DNA切除以及減數(shù)分裂性沉默19。

應用RNAi可以將特定的mRNA的基因表達沉默，因此很適合用于遺傳學研究，只要篩選出靶mRNA對應的siRNA，就可以通過細胞外導入siRNA來達到基因沉默的目的，這樣可以很方便地觀察某個基因的功能，同時也不會對其他的基因和細胞功能產(chǎn)生影響。

16 Nishikura K. A Short Primer on RNAi: RNA-Directed RNA Polymerase Acts as a Key Catalyst. Cell, 2001,107:415~418 17 Kumar P, Kim SS. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell, 2008, 134:577~586 18 Lassus P. Requirement for Caspase-2 in Stress-Induced Apoptosis Before Mitochondrial Permeabilization. Science, 2002, 297:1352~1354 19 RNA干擾：原理與應用，P.124，湯華，科學出版社，

References

I 參考書目

1 RNA干擾：原理與應用，湯華，科學出版社，2006

2 RNA干擾技術(shù)：從基礎(chǔ)科學到藥物開發(fā)，P.3，(美)Appasani K主編，殷勤偉等譯，科

學出版社，2007

II 參考文獻

1 Derek MD, Carl DN, Phillip A. Killing the messenger: Short RNAs that silence gene expression. Nature, 2004, 431: 343~349

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8 Elkayam E, Greene EM. The Structure of Human Argonaute-2 in Complex with miR-20a. Cell, 150:100~110

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17 Tijsterman M, Ronald H.A. Plasterk. Dicers at RISC: The Mechanism of RNAi.

RNA干擾技術(shù)論文篇二

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。它是生物進化過程中遺留下來的一種在轉(zhuǎn)錄后通過RNA調(diào)控基因表達的機制。最早的RNA干擾研究是從植物和線蟲開始，2001年Tuchl等首次應用長度約為19~23個堿基對的雙鏈小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)在哺乳動物細胞中誘發(fā)基因沉默現(xiàn)象，證實這些細胞也普遍存在RNA干擾的機制，從而在世界范圍內(nèi)掀起了研究和應用RNA干擾技術(shù)的熱潮。

RNA干擾之所以能引起生物醫(yī)學界幾乎所有研究領(lǐng)域的廣泛性趣，是因為siRNA具有強大的抑制基因表達的效應和高度的序列特異性。與抑制基因表達的傳統(tǒng)工具，如反義寡核苷酸和核酶等比較，siRNA沉默基因的效率高達數(shù)十到數(shù)千倍，是逆基因工具的革命性改進。此外與目標基因信使RNA相差一個堿基序列的siRNA的基因沉默效應大大受到削弱，從而保證了抑制目標基因的高度特異性。因此，siRNA的發(fā)現(xiàn)具有劃時代的意義，它不僅深入揭示了細胞內(nèi)基因沉默的機制，而且它還是基因功能分析的有力工具，極大地促進了人類揭示生命奧秘密的進程。siRNA本身還是一種極具前景的基因靶向藥物，可廣泛地用于諸如癌癥等疾病的治療。鑒于siRNA技術(shù)的巨大意義與廣闊應用前景，siRNA技術(shù)連續(xù)多年被美國《Science》雜志評選的“全球年度十大科學突破”。

由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療等領(lǐng)域。

第一節(jié) RNA干擾的研究歷程

雖然RNA干擾是一種古老的機制，但是第一篇報道這種現(xiàn)象的論文是在1990年發(fā)表的。

1990年，Napoli和Van der Krol等在研究矮牽?；ú闋柾驎r發(fā)現(xiàn)了基因共抑制現(xiàn)象(cosuppression)。她在體外構(gòu)建了控制矮牽?；ɑㄉ幕虿闋柾蚱危B上花椰菜花葉病毒的35S啟動子，連入農(nóng)桿菌的T-DNA質(zhì)粒，在矮牽?；ㄖ羞^度表達。她原先預期，查爾酮的過度表達能加深牽?；ɑㄉ淖仙?，但是結(jié)果卻導致了矮牽牛花子代花色的褪色，內(nèi)源性的查爾酮遭到沉默。Napoli教授把這一現(xiàn)象稱之為內(nèi)源性基因共抑制現(xiàn)象。 1998年，Andrew J. Hamilton教授研究了番茄ACC氧化酶基因的基因共抑制現(xiàn)象。他利用放射性標記法和放線菌酮處理法分析轉(zhuǎn)錄后ACC氧化酶基因的mRNA和成熟mRNA。實驗結(jié)果表明，外源重組基因片段能成功轉(zhuǎn)錄，但是mRNA成功轉(zhuǎn)錄后，因為某種原因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。因此，Andrew J. Hamilton認為內(nèi)源性基因共抑制現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。

1995年，Guo等發(fā)現(xiàn)注射正義RNA(sense RNA)和反義RNA(antisense RNA)均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲(C. elegans)par-1基因的表達，該結(jié)果不能使用反義RNA技術(shù)的理論做出合理解釋。直到1998年，F(xiàn)ire和Mello課題組接手了此課題。他們以秀麗新小桿線蟲為模型，發(fā)現(xiàn)在Guo的課題中，引發(fā)線蟲par-1基因沉默的是小片段的雙鏈RNA，而不是正義單鏈RNA或負義單鏈RNA。他們之后又研究了秀麗新小桿線蟲的unc-22基因，進一步闡述了雙鏈RNA在基因沉默中的作用，并將這一現(xiàn)象命名為“RNA干擾”。 他們的研究成果激起了其他科學家研究RNA干擾現(xiàn)象的濃厚興趣，由于他們的發(fā)現(xiàn)揭示了分子生物學中一個全新的，具有普遍性的機制，Andrew Fire, Craig C. Mello兩位科學家因此在2006年獲得諾貝爾獎。

此后dsRNA介導的RNAi現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中，并逐漸證實植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默、共抑制(cosuppression)及RNA介導的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)現(xiàn)象均屬于RNA干擾在不同物種的表現(xiàn)形式。

第二節(jié) RNA干擾原理

病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)，并利用宿主細胞進行轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA(圖1)。宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(大約21～23 bp)，即siRNA。研究表明在生物體中siRNA具相似的結(jié)構(gòu)特征：為長約21～23bp的雙鏈RNA，具5’單磷酸和3’羥基末端，互補雙鏈的3’端均有一個2～3nt的單鏈突出。負責將dsRNA轉(zhuǎn)化為siRNA的Dicer核酸酶，屬于RNaseⅢ家族，具有兩個催化結(jié)構(gòu)域、一個解旋酶(helicase)結(jié)構(gòu)域和一個PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille)結(jié)構(gòu)域，Dicer在催化過程中以二聚體的形式出現(xiàn)，其催化結(jié)構(gòu)域在dsRNA上反平行排列，形成四個活性位點，但只有兩側(cè)的兩個位點有內(nèi)切核酸酶活性，這兩個位點在相距約22bp的距離切斷dsRNA，各種生物體內(nèi)Dicer結(jié)構(gòu)略有不同，致使siRNA長度存在微小差別。

siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，導致特定基因沉默，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。

在RISC中，起靶序列識別作用的是siRNA的反義鏈，Zamore等發(fā)現(xiàn)在RNAi過程中，首先產(chǎn)生的是RISC無活性前體，分子量250kD，當加入ATP后可形成100kD的活性復合體。由無活性前體向活性酶復合物的轉(zhuǎn)換類似蛋白酶原的激活，但RISC酶復合物激活不需要共價鍵斷裂，而要求結(jié)合于其上的siRNA雙鏈的解開。在ATP存在時，依賴于ATP的解旋酶解開siRNA的雙鏈并將其正義鏈與靶mRNA置換，mRNA取代正義鏈與反義鏈互補，然后由活化的RISC在互補區(qū)的中間，距離siRNA反義鏈3’末端約12bp處切斷靶mRNA序列。

siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，經(jīng)過若干次的合成-切割循環(huán)，RNAi的作用不斷放大，最終將靶mRNA完全降解。

此外許多研究還顯示RNAi信號可以越過胞間屏障向其他細胞和組織擴散，在植物中，RNAi信號可以通過兩種途徑在細胞間傳遞：①短距離的相鄰細胞之間的傳遞，植物細胞之間有著非常豐富的連接——胞間連絲，沉默信號(如siRNA分子)可以通過胞間連絲在細胞間傳遞;②沉默信號還可以通過植物里縱橫交錯的脈管系統(tǒng)進行長距離的傳送。而在動物中，RNAi信號的擴散需要特殊的蛋白參與，Hunter等在線蟲中鑒定出了一種與沉默信號傳播相關(guān)的蛋白，它是由SID一1基因編碼的一種跨膜蛋白，能在膜上形成跨膜通道供沉默信號通過，SID-1蛋白同源物在果蠅中不存在，但有研究表明在哺乳動物中存在SID-1蛋白同源物。

RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內(nèi)。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應

基因沉默。所以正常機體內(nèi)各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。

懷特黑德生物醫(yī)學研究所的本杰明·劉易斯等研究人員發(fā)現(xiàn)小RNA能通過阻斷蛋白質(zhì)合成的方式調(diào)控基因表達。他們借助一個計算模型來確定小RNA和對應的基因，發(fā)現(xiàn)了miRNA控制很大一部分生命功能的證據(jù)。

研究人員比較了人類和狗、雞、鼠的基因組，對這幾個物種共有的蛋白質(zhì)合成基因與miRNA尋求對應關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管這幾個物種在3.1億年前就開始“分家”各自進化，但它們基因組中受miRNA調(diào)控的基因都占三分之一左右，而且這些基因在進化過程中都得以保存而未發(fā)生變化。劉易斯說，隨著更多的基因組數(shù)據(jù)發(fā)布以及實驗技術(shù)的進步，還可能發(fā)現(xiàn)更多的基因是由小RNA調(diào)控的。

線蟲中的RNA干擾模型

Tabara教授于1999年以秀麗新小桿線蟲為模型(圖2)，揭示了RNA干擾的原理。線蟲細胞上的跨膜蛋白SID-1引導細胞外的長鏈雙鏈RNA進入細胞質(zhì)，RNA立即與細胞質(zhì)內(nèi)的RDE-4，RDE-1蛋白形成復合體。然后DCR-1與DRH-1蛋白與該復合體結(jié)合，DCR-1蛋白將長鏈RNA切斷，得到RDE-1結(jié)合的siRNA復合物。RDE-1-si-RNA復合物在解旋酶的作用下解鏈，RDE-1蛋白脫去，RISC酶與正義鏈和反義鏈中的一條鏈結(jié)合，RISC-單鏈RNA復合物在引導下與靶mRNA結(jié)合。反義RNA與靶mRNA上同源的部分特異性結(jié)合，在RISC的作用下，靶mRNA鏈被切斷，無法與核糖體結(jié)合，翻譯成蛋白質(zhì)，引起基因沉默。同時，以反義RNA為引物，以mRNA為模板，在RdRP的作用下，生成新的siRNA反義鏈。這就是siRNA的級聯(lián)放大的機制。

RNA干擾現(xiàn)象介導的mRNA降解特異性強，同時由于放大機制的存在微量siRNA就能引起明顯的RNA干擾現(xiàn)象。線蟲中的RNA干擾機制比較典型，但是在高等生物中，RNA的機制又有細微差別。

隨著RNAi技術(shù)的不斷成熟，尤其在哺乳動物細胞中應用和載體轉(zhuǎn)染siRNA成功后，對腫瘤的研究有了前所未有的突破，研究的重點主要在以下幾個方面：

(1)癌基因及抑癌基因的敲除：腫瘤是機體遺傳和環(huán)境致癌因素以協(xié)同或序貫的方式，引起遺傳物質(zhì)DNA損傷、突變，同時伴隨有多個癌基因激活和抑癌基因失活，使正常細胞不斷增生、轉(zhuǎn)化而形成的新生物。因此，如果可以抑制體內(nèi)原癌基因的激活或者增強抑癌基因的活性，那么腫瘤的發(fā)生率就會降低，甚至可以永久地避免相關(guān)腫瘤的發(fā)生。

Brummelkamp等用病毒載體將siRNA導入人的胰腺癌細胞，可特異且穩(wěn)定地抑制癌基因K-RASV12的表達，這個癌基因的受抑使腫瘤的生長能力及惡性程度降低Yoshinouchi等向體外培養(yǎng)的SiHa宮頸癌細胞內(nèi)導入癌基因E6的siRNA后，發(fā)現(xiàn)SiHa細胞的生長受到抑制，且隨著E6癌基因的受抑，E7癌基因的量也下降;而p53蛋白的量增高，Rb蛋白的磷酸化程度也隨之降低，表明抑癌基因也受到了激發(fā)。更令人興奮的是，導入E6基因siRNA的SiHa細胞體內(nèi)接種后，較未受抑制的對照組生長明顯緩慢，甚至停止生長，這給在體基因治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。Shen等首次應用重組了siRNA的腺病毒載體，在人類乳腺癌細胞和人類肺癌細胞A549中成功抑制了抑癌基因p53和MCF-7。人類9號和22號染色體的置換使22號染色體上的BCR基因與9號染色體上的ABL基因融合，產(chǎn)生的BCR-ABL融合蛋白誘發(fā)酪氨酸激酶強激活而致白血病發(fā)生。Druker等在設(shè)計干擾基因的位點時選取了融合位點，使白血病細胞出現(xiàn)凋亡。

對基因的某個部分用siRNA進行特異性敲除也成為研究基因功能的一個重要手段，敲除后，可通過觀察細胞或生物基因性狀的改變來研究該段基因在生物體內(nèi)的真正作用。如神經(jīng)元泛肽C末端水解酶L1(neuronal ubiquitin C-terminal hydrolase,UCH-L1)在肺癌的某種細胞內(nèi)表達，而在正常的肺組織中卻沒有該物質(zhì)。Liu等在研究UCH-L1的作用時選擇了用RNAi來抑制，發(fā)現(xiàn)抑制了UCH-L1后腫瘤細胞反而生長旺盛，表明UCH-L1可能抑制腫瘤細胞的生長。在研究前列腺癌的過程中，Varambally等發(fā)現(xiàn)了一種EZH2蛋白，其在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌細胞中表達的量比正常組織細胞中高得多，因此可以作為一種腫瘤的標記物;而進一步用siRNA抑制該基因，可以使前列腺癌細胞的生長明顯受抑，提示EZH2可以作為腫瘤的靶點試用于前列腺癌的臨床治療。

bcl-2基因的主要作用是抑制細胞凋亡和延長細胞的存活。Lin等在人的前列腺癌細胞LNCaP中，用cDNA和mRNA寡核苷酸混合物D-RNAi抑制blc-2基因?qū)е铝嘶蜢o默，并使細胞凋亡。他們認為，前列腺癌細胞的blc-2高表達可以使腫瘤的抗凋亡能力增強，這為RNAi可能治療前列腺癌提供了依據(jù)。對食管腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，blc-xL基因也與細胞的抗凋亡有關(guān)，食管腺癌細胞表達blc-xL基因的能力明顯增強。體外培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)染siRNA后，blc-xL在mRNA水平減少了60%，在蛋白質(zhì)水平減少了50%。因此，細胞的抗凋亡能力也隨之下降。

(2)有關(guān)腫瘤性疾病信號傳導途徑的研究：Crans Vargas等用siRNA抑制了環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine monophosphate responseelement binding protein,CREB)，這種蛋白可能在急性白血病的信號傳導過程中起作用，抑制了該基因后，培養(yǎng)的白血病細胞生存數(shù)量明顯減少。我們還可以利用siRNA抑制一些腫瘤信號傳導途徑中的必要因素，來達到治療腫瘤的目的。

(3)腫瘤免疫逃逸方面的研究：人體自身的細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CLT)要殺傷腫瘤細胞必須靠靶細胞的主要組織相容性復合體-Ⅰ(major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)類分子的識別，如果MHC-Ⅰ類分子在腫瘤的表面表達下降，自身的CTL就無法識別，從而導致腫瘤的免疫逃逸。前髓細胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)基因是腫瘤抑制基因，如果PML可以抑制MHC-Ⅰ類分子的表達，那么這種白血病分子就可以逃逸體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，而Bruno等的研究發(fā)現(xiàn)，PML與MHC-Ⅰ類分子的表達沒有明顯關(guān)系，用RNAi等方法抑制PML后，預計的MHC-Ⅰ類分子下調(diào)并沒有出現(xiàn)，提示在人的PML細胞中并未通過PML下調(diào)MHC-Ⅰ類分子來逃逸宿主免疫系統(tǒng)。

實體瘤組織由瘤細胞及間質(zhì)構(gòu)成，而后者主要以新生血管成分為主，在腫瘤的生長和擴散中起重要作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族是已知特異性作用于內(nèi)皮細胞的生長因子，在血管生成中作用至關(guān)重要。Zhang等 在鼠的上皮卵巢癌細胞中，應用載體介導VEGF的siRNA，有效降低了實驗鼠的VEGF提示可以利用VEGF在腫瘤的血管生長中的重要作用來治療腫瘤。RNAi可以特異性抑制腫瘤內(nèi)的VEGF，而其他藥物的特異性遠不能及。Bertrand等在體外培養(yǎng)的Hela細胞和異種移植的小鼠體內(nèi)進行了RNAi與反義核酸抑制的對比實驗，結(jié)果顯示，RNAi的抑制效率遠高于反義核酸，而且持續(xù)的時間延長;在小鼠體內(nèi)反義核酸根本就沒有作用發(fā)生，而RNAi的活性仍然很高，推測反義核酸可能被體內(nèi)的核酸降解系統(tǒng)破壞了。Niu等在血管生成信號傳遞的過程中，用RNAi抑制Tie-2后，血管內(nèi)皮細胞的生存能力下降，而且還導致了Akt信號系統(tǒng)受阻，結(jié)果使血小板反應蛋白的量增加。血小板反應蛋白是一種內(nèi)源性抗血管生成物質(zhì)，可以調(diào)控腫瘤血管的生成及腫瘤的生長，甚至可以導致內(nèi)皮細胞的凋亡。

(4)提高腫瘤對化療及放療的敏感性：腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤細胞獲得了耐藥性，這種耐藥性常表現(xiàn)為腫瘤細胞對多種結(jié)構(gòu)不同、作用靶位不同、作用方式不同的抗腫瘤藥物具有抵抗性，稱為多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)。研究發(fā)現(xiàn)，這種耐藥性與腫瘤細胞的某些耐藥基因相關(guān)，主要的耐藥基因是多藥耐藥基因1(MDR1)，編碼相對分子質(zhì)量為170 000的跨膜糖蛋白P-gp/P-170。這種糖蛋白具有藥泵的作用，當其表達增高或功能異常增強時，能將腫瘤細胞內(nèi)的藥物“泵”出細胞外，使細胞能在高濃度的藥物環(huán)境中生存。針對該基因的RNAi可以使MDR1基因的水平下調(diào)而進一步提高細胞內(nèi)的藥物濃度，提高腫瘤細胞對化學治療的敏感性。Nieth等在人胃癌細胞EPG85-257RDB和胰腺癌細胞EPP85-188RDP中，應用siRNA成功抑制了MDR1基因及其表達產(chǎn)物，抑制效率達91%，兩種細胞對柔紅霉素的耐藥性抵抗分別降低了58%和89%。表明此種siRNA 也可以試用于腫瘤的治療，通過提高細胞對抗腫瘤藥物的敏感性來達到治療腫瘤的目的。對于p53基因缺陷的腫瘤細胞，因其G1期的檢查位點缺失，所以可以逃逸體內(nèi)的免疫。Wang等找到了可以在G2期激活檢測位點的Chk1、Weel和Myt基因，用siRNA分別抑制這幾個基因以后，宮頸癌細胞Hela出現(xiàn)了凋亡，而正常的乳腺細胞卻沒有出現(xiàn)凋亡。表明Chk1、Weel和Myt基因可以試用于放療及化療，以提高對p53基因缺失的腫瘤細胞的療效。細胞的DNA修復系統(tǒng)能對放射線所致的DNA, 損傷予以修復，從而導致腫瘤細胞對放射治療的抵抗，而雙鏈DNA打開后的修復錯誤可以使腫瘤細胞對放射治療的敏感性提高。DNA活化的蛋白激酶接觸反應多肽(PRKDC)參與了DNA雙鏈的修復，如果PRKDC被siRNA抑制，細胞的放射敏感性就能大大提高，就可以通過減少放射劑量來降低放療的副作用。

目前，RNAi的體內(nèi)研究逐步深入。Hasuwaa等在轉(zhuǎn)基因的小鼠及大鼠胚胎細胞中注入帶有siRNA的載體，發(fā)現(xiàn)胚胎中的各個器官均廣泛地出現(xiàn)了特異性的抑制現(xiàn)象。Sorensen等通過靜脈注射或腹腔注射兩種不同的方式分別將帶有RNAi的陽離子脂質(zhì)體植入成年小鼠體內(nèi)，達到了抑制內(nèi)源性及外源性基因的目的，并且認為合成的RNAi可以在體內(nèi)達到與普通藥物相同的功能。如果RNAi技術(shù)將來能應用于臨床，將使腫瘤的治療變得簡單方便。