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電鏡技術(shù)論文

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電鏡技術(shù)論文

  電鏡技術(shù)已廣泛用于病毒的形態(tài)特征、分子結(jié)構(gòu)以及與宿主細(xì)胞相互作用的研究,學(xué)習(xí)啦小編為大家整理的電鏡技術(shù)論文,希望你們喜歡。

  電鏡技術(shù)論文篇一

  電鏡樣品制備技術(shù)的應(yīng)用

  【關(guān)鍵詞】 電鏡樣品;制備;咨詢

  隨著科技和 經(jīng)濟(jì) 的高速 發(fā)展 ,科研、醫(yī)療及診斷水平快速提高, 電子 顯微鏡在 現(xiàn)代 生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛,研究內(nèi)容越來越豐富,針對性越來越強(qiáng),加之生物樣品多樣化,對電鏡樣品制備技術(shù)提出了更多更高的要求。為了避免實驗的盲目性,避免因解釋不夠、實驗準(zhǔn)備不充分、操作不當(dāng)引起的糾紛,減少實驗的失敗率,務(wù)必要抓好電鏡樣品制備技術(shù)。

  1電鏡樣品制備的基本要求

  首先根據(jù)實驗的需要,擬定實驗計劃,制定出實驗流程,根據(jù)經(jīng)濟(jì)承受能力合理選擇實驗分組和時相點。其次,正確取材腹腔鏡下賁門食管區(qū)局部解剖的臨床意義很關(guān)鍵:取材固定要快,必須在固定液中及時修小。固定液由電鏡室提供,不能自己配制(特殊標(biāo)本除外)。標(biāo)本保存在4 ℃冰箱,不得冰凍。樣品處理步驟多而復(fù)雜,耗時長,所以要預(yù)計鏡下觀察結(jié)果的時間,便于安排實驗。

  2特殊電鏡樣品的制備方法

  針對不同的實驗?zāi)康?,不同的?biāo)本取材,尋求不同的電鏡樣品制備方法。作者經(jīng)過長期的實驗反復(fù)摸索,得到許多有應(yīng)用價值的新技術(shù)、新方法,為有類似課題研究的科研人員的電鏡技術(shù)咨詢提供理論依據(jù)。例如要觀察組織細(xì)胞中的鈣,只有采用鈣離子捕捉法,通過細(xì)胞化學(xué)間接地來進(jìn)行鈣的定位[1]。為了促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)鈣化學(xué)充分反應(yīng),就如何選擇底物、捕捉劑、如何配制試劑和灌注固定等進(jìn)行摸索,得到有效的、可行的電鏡樣品制備方法,可供 參考 。如果要觀察培養(yǎng)細(xì)胞間連接,建議采用改進(jìn)的薄膜細(xì)胞培養(yǎng)法,優(yōu)勢在于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保存良好,能保持細(xì)胞間原有的位置關(guān)系,利于反復(fù)切片,解決了單層培養(yǎng)細(xì)胞頂扣包埋后切片難、成功率低的問題[2]。懸浮細(xì)胞培養(yǎng),懸浮物質(zhì)作為懸浮細(xì)胞生長載體是近年組織工程研究的新方法,如何觀察懸浮細(xì)胞生長狀態(tài)的真實超微結(jié)構(gòu)圖像是電鏡制樣的新課題。改進(jìn)的懸浮細(xì)胞直接沉降法和懸浮物質(zhì)直接移液法,解決了傳統(tǒng)的懸浮細(xì)胞掃描電鏡制樣細(xì)胞和物質(zhì)容易丟失、細(xì)胞表面特殊微細(xì)結(jié)構(gòu)保存不好的問題[3]。電鏡免疫技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛,但制樣復(fù)雜,影響因素多,陽性率低。在樣品制備技術(shù)咨詢時,根據(jù)實驗要求和不同的組織細(xì)胞,不斷查閱 文獻(xiàn) ,共同探討,合理選擇標(biāo)記物、固定液、免疫染色和電子染色等,使免疫電鏡技術(shù)不斷提高,逐步成熟,為科研快速發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

  3利用電鏡技術(shù)用戶資源提供技術(shù)咨詢

  電鏡室是為科研人員服務(wù)的,是設(shè)備和專業(yè)技術(shù)力量較集中的單位。為了提高創(chuàng)新能力,擴(kuò)大交流合作,加強(qiáng)校內(nèi)外信息溝通,與科研人員共同建立了電鏡技術(shù)用戶資源共享平臺,提供相關(guān)的技術(shù)咨詢服務(wù)。建立電鏡技術(shù)用戶資源庫,詳細(xì)記錄了用戶名、實驗日期、實驗?zāi)康?、?biāo)本類型、制樣步驟和方法、實驗結(jié)果、所在單位和聯(lián)系電話等,相關(guān)科研人員只需采取簡單而靈活的電話咨詢或發(fā)郵件等方式進(jìn)行技術(shù)經(jīng)驗交流,包括試劑的購買廠家或貴重試劑合用,試劑的配制,實驗流程,標(biāo)本處理方法,實驗操作中的改進(jìn)措施,實驗結(jié)果的分析等。實踐證明,實驗前通過用戶與電鏡專業(yè)技術(shù)人員、用戶與用戶之間的電鏡技術(shù)咨詢,相互借鑒,共同探討,促進(jìn)了科研人員之間的交流與合作,擴(kuò)大了宣傳。實驗成功的技術(shù)方法和理論成果被廣泛推廣應(yīng)用,電鏡技術(shù)不斷被刷新,積累了許多有應(yīng)用價值的電鏡樣品制備經(jīng)驗,豐富了形態(tài)學(xué)研究的內(nèi)容。

  科研的成功在于把關(guān)每個環(huán)節(jié),對于形態(tài)學(xué)研究要認(rèn)真對待電鏡樣品制備技術(shù)的咨詢,明確方向,擬訂實驗方案,不斷創(chuàng)新并解決技術(shù)難題,才能使超微結(jié)構(gòu)研究取得突破性進(jìn)展,適應(yīng) 現(xiàn)代 醫(yī)學(xué)的 發(fā)展 。

  【 參考 文獻(xiàn) 】

  [1] 陶忠芬,李文剛,等.大鼠膀胱平滑肌過度充盈后鈣離子分布的變化[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2006,28(6):608-609.

  [2] 趙娟,徐淑梅.一種淀粉樣蛋白電鏡標(biāo)本制備的新方法[J].天津醫(yī)藥,2007,35(4):287-288.

  [3] 路菊,陶忠芬,等.懸浮狀物質(zhì)的樣品制備及掃描電鏡觀察[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2007,29(4):368-369.

  電鏡技術(shù)論文篇二

  浮游病毒的電鏡觀察

  摘要:直接用戊二醛固定水樣中的浮游病毒,通過超速離心使已固定的浮游病毒沉淀到覆有Formvar膜和碳支持膜的銅網(wǎng)上,經(jīng)醋酸雙氧鈾染色后,利用透射電鏡對湖水中的浮游病毒進(jìn)行觀察,結(jié)果可觀察到球形、桿狀和蝌蚪狀等形態(tài)各異的浮游病毒顆粒及球形病毒的囊膜子粒、桿狀病毒的核衣殼、具有不同尾部的蝌蚪狀病毒等的精細(xì)超微結(jié)構(gòu),從而建立了一種簡便、快捷和高效研究浮游病毒的電鏡方法。

  關(guān)鍵詞:電鏡觀察;浮游病毒:超微結(jié)構(gòu)

  中圖分類號:Q939.48

  文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

  文章編號:1007-7847(2007)01-0048-04

  電鏡技術(shù)已廣泛用于病毒的形態(tài)特征、分子結(jié)構(gòu)以及與宿主細(xì)胞相互作用的研究,電鏡觀察可為病毒的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及分類定位提供最直觀的依據(jù),但要通過電鏡對水樣中的病毒進(jìn)行觀察,通常必須對水樣進(jìn)行濃縮和病毒分離,

  浮游病毒是存在于水體中的病毒,浮游病毒也是指水生態(tài)系統(tǒng)中的病毒,目前被普遍認(rèn)為是水體微生物群落中豐富且重要的活性成分,它能調(diào)節(jié)水體中異養(yǎng)細(xì)菌,藍(lán)藻和真核藻類的物種多樣性和生物產(chǎn)量,影響生物地化循環(huán),介導(dǎo)水生態(tài)系統(tǒng)中微生物之間的基因轉(zhuǎn)換,對水環(huán)境乃至整個生態(tài)系統(tǒng)都具有重要影響,因此受到人們的廣泛關(guān)注,近些年已有報道指出,浮游病毒存在不同的形態(tài)類群。

  從水樣中分離濃縮病毒,不僅過程繁雜、耗時長、費用高,還會使水樣中病毒的數(shù)量及完整性受損,可否免去分離濃縮程序,直接對水樣中的浮游病毒進(jìn)行制樣和電鏡觀察呢?因此,本文著重對水樣中浮游病毒樣品的不同制備方法及電鏡觀察效果進(jìn)行比較。

  1 材料與方法

  1.1 水樣的采集

  將取樣器浸入武漢東湖水面以下10cm處取出水樣,裝入收集瓶內(nèi),立即加入戊二醛(按體積比水樣:戊二醛=9:1,使之終濃度為2.5%)進(jìn)行固定,并迅速將固定后的水樣置于4℃冰箱內(nèi)保存,備用。

  1.2 制樣

  方法之一:水樣直接滴到銅網(wǎng)上,采用常規(guī)的滴染法,即把水樣直接滴在覆有Formvar膜和碳支持膜的銅網(wǎng)上,使形成一小液珠,放置片刻,用濾紙條吸去多余的液體,自然干燥。

  方法之:水樣經(jīng)超速離心到銅網(wǎng)上,參照劉艷鳴等的方法(2005),以25000r/min離心3h,使病毒沉淀到銅網(wǎng)上,棄去上清,空氣干燥,

  1.3 染色

  醋酸雙氧鈾染色,在蠟盤中滴加2%的醋酸雙氧鈾,然后將上述干燥好的銅網(wǎng)漂浮在染液上,染色2-3min。

  磷鎢酸染色,將2%的磷鎢酸滴加到蠟盤中,將上述干燥好的銅網(wǎng)插入其中,染色2-3min,

  1.4 電鏡觀察

  在JEM-1230型透射電鏡下觀察,加速電壓為100kV,利用GATAN INC CCD圖像傳輸系統(tǒng),獲得電鏡圖片。

  2 結(jié)果

  2.1 制樣方法對觀察效果的影響

  我們分別采用了兩種制樣方法和兩種染色方法。結(jié)果顯示:不同的制樣和染色方法對電鏡觀察效果有明顯的影響。

  利用方法一所制備的樣品,無論經(jīng)醋酸雙氧鈾染色,還是磷鎢酸染色,都存在雜質(zhì)多,背景暗,而病毒顆粒少的情況,甚至許多視野看不到病毒顆粒,可見,該方法不適宜制備浮游病毒的樣品。

  利用方法二所制備的樣品,經(jīng)磷鎢酸染色后,整個圖像背景雜亂,病毒顆粒分布不均勻,形態(tài)模糊,該方法也無法對水樣中的浮游病毒進(jìn)行準(zhǔn)確觀察。

  同樣利用方法二所制備的樣品,經(jīng)醋酸雙氧鈾染色后,可觀察到大量形態(tài)和數(shù)量不同的病毒顆粒,因此該方法可有效用于浮游病毒的形態(tài)觀察及計數(shù)分析,下述電鏡圖片均是通過該方法得到的。

  2.2 浮游病毒的種類、形態(tài)及精細(xì)結(jié)構(gòu)

  用方法二所制備的浮游病毒樣品,在透射電鏡下,不僅可清晰地觀察到病毒顆粒的形態(tài),如球形、桿狀和蝌蚪狀等(圖1),還能了解其部分精細(xì)結(jié)構(gòu),包括球形病毒的子粒、桿狀病毒的核衣殼(橫紋狀結(jié)構(gòu))和蝌蚪狀病毒的尾髓等.

  2.3 浮游病毒的計數(shù)分析

  在進(jìn)行樣品觀察時,可以根據(jù)需要來調(diào)節(jié)電鏡的放大倍數(shù),如要了解病毒的精細(xì)結(jié)構(gòu)時,可將放大倍數(shù)調(diào)節(jié)到8-10萬倍;如要對水樣中的浮游病毒進(jìn)行計數(shù)分析,就將放大倍數(shù)調(diào)低至2萬倍左右,在此條件下,視野較寬,病毒的形態(tài)及數(shù)量都清晰觀察到

  3 討論

  我們采用了不同的制樣和染色方法,對水體中的浮游病毒進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示,常規(guī)的直接滴染法雖然簡便快捷,但由于浮游病毒在水體中的含量與分離或純化后的樣品相比,其量相對較少且分布不均勻,圖像背景雜亂、不清晰,故很難獲得滿意的電鏡圖片,其原因可能是浮游病毒和水中的其它浮游生物、細(xì)胞碎片等固體雜質(zhì)混在一起,吸附到銅網(wǎng)上,對病毒形態(tài)的觀察和圖片拍攝造成干擾。

  采用超離法制樣,可得較好的結(jié)果,這是由于在離心力的作用下,一些比病毒顆粒要大的物質(zhì)首先沉降到銅網(wǎng)上,并形成一個電子密度高且較均勻的背景,為浮游病毒的觀察起托襯作用,值得注意的是,此方法的離心速度較為關(guān)鍵,實驗表明,用25000r/min的轉(zhuǎn)速(Beckman L-90K超速離心機(jī),SW41轉(zhuǎn)頭)比較適宜,這是由于用過大的離心速度,就會使有蝌蚪狀病毒的尾巴折斷或損傷;而離心速度過小,則難使體積較小的病毒沉降到銅網(wǎng)上,不能全面真實地反映待檢水體中浮游病毒的形態(tài)多樣性及含量等情況,另外,每次離心加入待測水量的多少,要根據(jù)水樣中浮游生物、其它懸浮顆粒物的含量以及湖水的富營養(yǎng)化程度等因素來定,在超富營養(yǎng)區(qū)的水樣中,細(xì)菌、藻類等浮游生物及其它懸浮雜質(zhì)較多,每次可加入1mL左右的水樣;而來自富營養(yǎng)區(qū)的水樣,每次加入1.5mL左右;來自中等營養(yǎng)區(qū)的水樣,則要加入2mL左右,這樣才能使離心到銅網(wǎng)上的樣品分布均勻、數(shù)量適中,能獲得較好的觀察效果。

  用磷鎢酸對浮游病毒進(jìn)行染色,只產(chǎn)生負(fù)染效應(yīng),由于它與支持膜的粘附作用很弱,染色后的標(biāo)本不能久留,因此,常難以觀察到浮游病毒的精細(xì)結(jié)構(gòu),當(dāng)我們選用醋酸雙氧鈾溶液作為染色劑時,由于醋酸雙氧鈾可產(chǎn)生正染和負(fù)染兩種效果,在銅網(wǎng)中雜質(zhì)多、背景暗的區(qū)域可觀察到淺色的病毒顆粒;在淺色的背景下則可觀察到深色的病毒顆粒,因此,處理得當(dāng),就能有效觀察到不同背景條件下的浮游病毒顆粒,同時,醋酸雙氧鈾容易與支持膜粘附,產(chǎn)生較強(qiáng)的反差,染色后的標(biāo)本較穩(wěn)定,有利于保存。

  在建立了適宜浮游病毒制樣和染色方法的基礎(chǔ)上,獲得了不同病毒顆粒形態(tài)的圖片、病毒精細(xì)結(jié)構(gòu)的圖片,這顯示所建立的方法,能簡便、有效地用于浮游病毒的研究,包括用于浮游病毒的計數(shù)分析。

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