分子印跡技術(shù)論文(2)
分子印跡技術(shù)論文篇二
生物大分子印跡傳感器研究進(jìn)展
摘 要 分子印跡傳感器在有機(jī)小分子分析檢測方面的應(yīng)用已趨近成熟，在生物大分子檢測方面的應(yīng)用近年來也逐漸增多。本文就近年來分子印跡技術(shù)在大分子生物傳感器中的構(gòu)建及應(yīng)用進(jìn)行綜述，包括光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器、質(zhì)量型傳感器等，并對目前分子印跡傳感器在生物大分子檢測方面存在的問題進(jìn)行分析，對生物大分子印跡傳感器的未來發(fā)展方向提出展望。
關(guān)鍵詞 分子印跡傳感器; 生物大分子; 綜述
1 引 言
1.1 分子印跡技術(shù)
1.1.1 分子印跡的發(fā)展 分子印跡起源于20世紀(jì)30年代，Polyakov[1]和Dicky[2]首次提出了特異性吸附的硅膠，研究其對甲基橙和乙基橙的特異性吸附能力。此后，研究者一直局限于“抗原-抗體”相互作用的思維。直到1972年，Wulff等[3]提出了“分子印跡(Molecular imprinting)”的概念，成功制備了具有對D-甘油酸對映選擇性的分子印跡聚合物，使分子印跡技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展。1993年Vlatakis 等[4]在《Nature》上發(fā)表了關(guān)于茶堿分子印跡聚合物的研究，對分子印跡具有的特異性識別能力進(jìn)行了第一次系統(tǒng)性的描述，形象地將分子印跡聚合物稱為“塑料抗體”[5]。該文章的發(fā)表直接促進(jìn)了分子印跡技術(shù)在近20年內(nèi)的飛速發(fā)展。目前，分子印跡技術(shù)已在材料學(xué)[6]、分析化學(xué)[7]、生物化學(xué)[8，9]、生物醫(yī)藥[10]學(xué)科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。然而，分子印跡在蛋白質(zhì)乃至生物大分子方面的應(yīng)用仍然是最具有挑戰(zhàn)性的課題之一。1985年，Glad等[11]利用有機(jī)硅烷單體制備了蛋白質(zhì)分子印跡聚合物，在高效液相色譜中表現(xiàn)出對糖蛋白的親和性。由于生物大分子尺寸巨大、構(gòu)象復(fù)雜，分子印跡技術(shù)在生物大分子的應(yīng)用進(jìn)展緩慢。直到表面分子印跡技術(shù)[12]及抗原決定簇[13]印跡方法的興起，生物大分子印跡漸漸成為了分子印跡研究的熱點(diǎn)。本文主要就分子印跡技術(shù)在生物大分子傳感器中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。
1.1.2 分子印跡技術(shù)基本原理 分子印跡技術(shù)主要原理[14]是將功能單體、模板分子以交聯(lián)劑或者電聚合的方式通過特殊的作用力相結(jié)合制備出分子印跡聚合物，而后通過一定的溶劑或者其它方式洗脫除去模板分子留下與模板分子大小、形狀、空間構(gòu)型都互補(bǔ)的孔穴，從而具有對模板分子進(jìn)行特異性識別的能力。構(gòu)成分子印跡技術(shù)的基本要素有： (1)功能單體 與模板分子形成識別位點(diǎn);(2)交聯(lián)劑 將功 能單體與模板分子固定下來形成具有一定空間構(gòu)象的高聚物;(3)引發(fā)劑 通常分子印跡有化學(xué)聚合和電聚合兩種方式，在化學(xué)聚合中需要特定的引發(fā)方式如光、電、熱、化學(xué)物質(zhì)等將已連接單體的模板分子通過交聯(lián)劑形成分子印跡聚合物;(4)洗脫劑 對已聚合的物質(zhì)進(jìn)行洗脫處理，從而形成對目標(biāo)物質(zhì)具有特異性識別能力的孔穴。
基于功能單體與模板分子之間的相互作用力的不同，研究者提出了3種聚合物結(jié)合方式： (1)由Wulff等[3]提出的預(yù)組裝法，功能單體與模板分子間以可逆的共價(jià)鍵相結(jié)合，通過打斷共價(jià)鍵的方式去除模板分子，由于共價(jià)鍵較為穩(wěn)定，其所形成的分子印跡聚合物也較穩(wěn)定，印跡孔穴的結(jié)合位點(diǎn)較為均一，但同時(shí)也導(dǎo)致了洗脫過程和響應(yīng)時(shí)間較長。(2)Vlatakis 等 [4]提出了以“非共價(jià)作用”自組裝模板分子，主要以氫鍵、范德華力、π鍵等弱作用力將單體與模板分子相結(jié)合，降低了模板分子洗脫的難度，加快了響應(yīng)時(shí)間。(3)1995年，Whitcombe等[15]結(jié)合了共價(jià)作用和非共價(jià)作用，提出了“半共價(jià)法”，在聚合過程中用共價(jià)鍵的形式結(jié)合，而通過非共價(jià)作用進(jìn)行特異性識別，提高了分子印跡聚合物的穩(wěn)定性的同時(shí)，加快了印跡識別的響應(yīng)時(shí)間，成功制備了膽固醇分子印跡聚合物。
1.1.3 分子印跡技術(shù)特點(diǎn)與應(yīng)用 分子印跡技術(shù)具有顯著的特點(diǎn)： (1)構(gòu)象預(yù)定性 分子印跡聚合物中的模板分子是預(yù)先設(shè)定的，根據(jù)模板分子的不同，可以選擇不同的單體進(jìn)行分子印跡聚合物的制備。(2)識別特異性 模板分子在經(jīng)過單體、交聯(lián)劑的共同作用下形成剛性空間結(jié)構(gòu)，在洗脫模板分子后，聚合物空腔中依然存在與模板分子特異性結(jié)合的位點(diǎn)，從而達(dá)到類似于抗原-抗體的相互作用機(jī)制。(3)環(huán)境耐受性 聚合物具有的剛性結(jié)構(gòu)決定了它具有優(yōu)良的環(huán)境耐受性，耐酸堿、耐高溫、抗惡劣環(huán)境等。(4)使用壽命長 可重復(fù)使用、造價(jià)低廉和穩(wěn)定性高。這些特點(diǎn)為分子印跡材料在仿生傳感器[16，17]、靶細(xì)胞給藥[18]、模擬酶[19，20]、固相萃取[21，22]等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但分子印跡技術(shù)應(yīng)用的模板多數(shù)為有機(jī)物[23～27]、金屬離子配合物[28，29]等小分子化合物，而對生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA、病毒等的應(yīng)用總體處于研究的初期階段。因此，有必要對分子印跡在生物大分子中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，從而尋求更大的突破。
1.2 生物大分子及印跡技術(shù)
生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬或更多的有機(jī)分子。生物大分子大多數(shù)是由簡單的生物單分子聚合而成的，蛋白質(zhì)的組成單位是氨基酸，核酸的組成單位是核苷酸等，它們是構(gòu)成大分子的基本物質(zhì)[30]。蛋白質(zhì)、核酸和多糖是3類主要的生物大分子，它們在分子結(jié)構(gòu)和生理功能上差別很大，然而，在以下幾個(gè)方面又顯示出共性： (1)在活細(xì)胞內(nèi)，生物大分子和相應(yīng)的生物小分子之間的互變，通常通過脫水縮合，或加水分解。蛋白質(zhì)鏈(或稱肽鏈)、核酸鏈和糖鏈都有方向性，盡管方向性的體現(xiàn)各不相同。(2)蛋白質(zhì)、核酸和多糖分子都有各具特征的高級結(jié)構(gòu)，正確的高級結(jié)構(gòu)是生物大分子執(zhí)行其生物功能的必要前提。(3)在活細(xì)胞中，三類生物大分子密切配合，共同參與生命過程，很多情況下形成生命活動(dòng)必不可少的復(fù)合大分子，如核蛋白、糖蛋白。隨著生物醫(yī)學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，對蛋白質(zhì)等生物大分子的檢測也受到了極大的關(guān)注，建立快速、簡單、特異性強(qiáng)、高通量的生物大分子檢測方法已經(jīng)成為分析科學(xué)的研究重點(diǎn)之一。從1991年Dhal等[31]利用Cu2+的配位作用，制備了對咪唑化合物進(jìn)行分子識別的表面分子印跡聚合物至今，將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)[16，32，33]、DNA[34～37]、細(xì)胞[38，39]、病毒[40，41]等生物大分子檢測識別的研究一直是分子印跡應(yīng)用的主要方向之一。據(jù)Web of Science統(tǒng)計(jì)，相關(guān)的年發(fā)表文獻(xiàn)量由1996年的10余篇增加到2014年的100余篇。 與小分子印跡技術(shù)相比，大分子印跡技術(shù)存在更大的困難和挑戰(zhàn)。首先，模板分子的洗脫及識別困難是大分子印跡技術(shù)面臨的最主要問題。目前報(bào)道中，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醇、PBS緩沖是常規(guī)印跡技術(shù)中洗脫的常用手段，而在蛋白質(zhì)等大分子印跡中，因尺寸較大，洗脫效果一直存在效率過低的問題[8]。此外，高度交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)還導(dǎo)致了目標(biāo)分子擴(kuò)散受到限制，從而結(jié)合能力低，平衡時(shí)間較長。表面分子印跡技術(shù)是目前解決模板分子傳質(zhì)阻力較大的主要方法，例如印跡納米絲或印跡納米微球等[33，42，43]。在此基礎(chǔ)上，利用蛋白酶的降解作用來洗脫模板蛋白受到蛋白分子印跡研究者的重視[44]，Moreira等[32]在酰胺化的金電極表面先固定肌紅蛋白，采用丙烯酰胺類功能單體，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺作交聯(lián)劑在電極表面自組裝分子印跡層，然后用蛋白酶K消解除去模板肌紅蛋白。以鐵氰化鉀為離子探針，采用方波伏安法(SWV)測量，檢出限達(dá)0.28 μg/mL，其原理如圖1。
Wang等[45]在玻璃基質(zhì)表面利用硼酸親和作用先共價(jià)結(jié)合模板糖蛋白，通過自聚合多巴胺和間氨基苯硼酸形成親和力導(dǎo)向可控的表面分子印跡聚合物，在高pH環(huán)境中顯示高效的硼酸親和作用，在酸性環(huán)境中呈現(xiàn)較低的親和作用。以辣根過氧化氫酶(HRP)為例，當(dāng)pH=9.0時(shí)解離常數(shù)Kd=6.6×10 9，pH=3.0時(shí)， Kd=2.7×10 7，且在pH調(diào)整中并不影響分子印跡的特異性識別能力，表現(xiàn)出良好的選擇性。其原理如圖2。
此外，用于制備MIP的介質(zhì)種類有限。在有機(jī)相中制備MIP已經(jīng)日漸成熟，而以水溶液為介質(zhì)的制備研究卻較少，而生物分子酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)通常在水環(huán)境中較穩(wěn)定。研究水相中生物大分子印跡膜的合成方法是一個(gè)重要方向。最后，生物大分子印跡識別的機(jī)理還沒有得到較為完整且系統(tǒng)的理論，大分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和印跡聚合物作用力的多樣性都成為其機(jī)理研究主要困難，只有解決了這個(gè)問題才會(huì)使大分子印跡傳感器得到進(jìn)一步的發(fā)展。
2 生物大分子的分子印跡方法
將分子印跡技術(shù)應(yīng)用到蛋白質(zhì)等大分子至今，其印跡方法可以分為： (1)整體印跡[46～48](Bulk imprinting)，整體印跡又稱為包埋法，主要特征是模板分子大都聚合在印跡物內(nèi)部，在印跡過程中由于傳質(zhì)阻力的增大存在再識別的效率不高，聚合物有效尺寸過低等問題。常用的聚合方法有本體聚合、懸浮聚合、乳液聚合和沉淀聚合等。(2)表面印跡法 (Surface imprinting)， 區(qū)別于整體印跡技術(shù)的三維印跡，表面分子印跡是指在載體或者基質(zhì)表面制備分子印跡聚合物，由于其識別位點(diǎn)位于載體或者基質(zhì)的表面，在一定程度上降低了印跡孔穴洗脫和再識別的傳質(zhì)阻力，特別適合于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離檢測。表面印跡的方式主要有電聚合[49]、印跡微球[50]、印跡納米粒子[33，51，52]等。(3)抗原決定基法[13，53，54](Epitope approach)又名“子結(jié)構(gòu)”印跡方法[55]，受抗原-抗體相互通過一小段活性位點(diǎn)進(jìn)行識別的啟發(fā)，近年來，研究者在蛋白質(zhì)分子印跡中，將一小段暴露的蛋白多肽序列作為模板分子進(jìn)行印跡，得到的聚合物不僅能識別這一段多肽序列，更能進(jìn)一步的識別整個(gè)蛋白質(zhì)大分子，從而避免了由于蛋白尺寸過大導(dǎo)致的識別效率過低、傳質(zhì)阻力過大等困難，同時(shí)，小段多肽聚合物材料具有更優(yōu)良的特異性識別作用，近年受到越來越多的研究者的關(guān)注。
3 大分子印跡傳感器
受益于分子印跡聚合物類似于生物識別系統(tǒng)(抗原-抗體、酶-底物、激素-受體等)的高選擇特異性，且具有比生物識別材料更好的環(huán)境耐受性、更低的制作成本、更好的穩(wěn)定性。生物傳感器的敏感元件使用的酶、激素等生物敏感材料對適用條件和環(huán)境的苛刻要求，極大地限制了其發(fā)展。分子印跡技術(shù)不僅擁有生物傳感器的高識別能力，同時(shí)具有生物敏感材料所缺少的高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，因而分子印跡傳感器是生物傳感器的理想發(fā)展方向之一。隨著分子印跡聚合物的模板分子不只是局限于小分子印跡，將分子印跡應(yīng)用于傳感器方向?qū)⒂懈鼮閺V闊的應(yīng)用前景，例如制作一些具有免疫抑制性的人工抗體。
分子印跡聚合物的合成是分子印跡研究的關(guān)鍵步驟，當(dāng)洗脫完成后MIPs與模板分子結(jié)合，產(chǎn)生物理或者化學(xué)信號，轉(zhuǎn)換器(壓電晶體、電極、電阻等)將信號轉(zhuǎn)換為可定量輸出的檢測信號，通過檢測信號實(shí)現(xiàn)對待測物質(zhì)的檢測，這就是一個(gè)傳感的過程，根據(jù)轉(zhuǎn)換信號的不同，可以大致的分為光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器、質(zhì)量型傳感器。
3.1 光學(xué)型印跡傳感器
光學(xué)傳感與分子印跡聯(lián)用通常有熒光[56]、發(fā)光[57]和表面等離子共振[58](SPR)型。光學(xué)傳感具有的高靈敏度，分子印跡光學(xué)傳感的檢出限在小分子檢測中通常能達(dá)到ng級，因此，人們正在積極探索將其應(yīng)用于痕量大分子檢測的可能性。Sunayama等[59]合成了一種由甲基丙烯?；?、仲胺基、苯甲酸基三種功能團(tuán)構(gòu)成的單體，在改性的玻璃基質(zhì)上制備了溶菌酶分子印跡膜，在移除溶菌酶分子后，在MIP仲胺基上引入熒光染料，只有當(dāng)靶蛋白與分子印跡膜重新結(jié)合后，才能產(chǎn)生熒光信號，通過熒光信號的差異檢測目標(biāo)蛋白，測定結(jié)果可與SPR相媲美。采用類似的策略，Sunayama等[60]合成了一種新的功能單體MDTA，將蛋白識別信號轉(zhuǎn)換為熒光信號，其檢測原理如圖3。Liu等[61]用磁性納米粒子來進(jìn)行MIP表面印跡物的分離，用熒光探針檢測信號，建立了對目標(biāo)酶蛋白的選擇性檢測的新方法。其在Fe3O4磁性納米粒子表面印跡了對DNase I具有特異選擇性的聚合納米材料，通過外加磁場分離出目標(biāo)酶蛋白聚合物，進(jìn)而洗脫出DNase I，用熒光探針進(jìn)行酶含量的檢測。
3.2 分子印跡電化學(xué)傳感器
分子印跡電化學(xué)傳感器(MIECSs)是目前最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的傳感器體系，根據(jù)響應(yīng)信號的不同可以分為電流(安培和伏安)、電位、電導(dǎo)、電容(阻抗)、場效應(yīng)等類型。其中報(bào)道最多的傳感器主要是電流型和電容型，它們的主要區(qū)別是MIPs與模板分子進(jìn)行重吸附后產(chǎn)生的檢測信號的不同。分子印跡電化學(xué)傳感器的印跡敏感膜制備方法大致有電聚合法、滴涂法、原位引發(fā)聚合以及自組裝法。電聚合法是使用最為廣泛且較為成熟的聚合膜制備方法，通?？梢苑譃楹汶娢环?、恒電流法以及循環(huán)伏安法。循環(huán)伏安法可通過對電化學(xué)參數(shù)及掃描圈數(shù)來控制成膜的厚度，重現(xiàn)性良好且操作較為簡便而應(yīng)用廣泛。電聚合采用的功能單體有導(dǎo)電型和非導(dǎo)電型。在大分子印跡領(lǐng)域，還對單體的生物相容性提出了要求。導(dǎo)電型印跡膜單體通常有吡咯、苯胺等，非導(dǎo)電型單體主要采用鄰苯二胺、對氨基苯硫酚、苯酚等。 3.2.1 電容(阻抗)型傳感器
電容型分子印跡傳感器依據(jù)的是以印跡膜選擇性識別目標(biāo)分子前后電容或阻抗的變化作為檢測信號，其優(yōu)點(diǎn)是不需要外加試劑或者探針，可以提供實(shí)時(shí)信號，特別適用于一些非電活性物質(zhì)的檢測。
Cai等[16]在玻璃基板上生長碳納米管陣列，嵌入SU8-2002聚合材料，以苯酚為單體，構(gòu)建了人體鐵蛋白的阻抗型電化學(xué)傳感器，檢測的線性范圍達(dá)到1×10 12 ～ 1×10 7 g/L，其原理見圖4。Zhang等[62]用溶膠-凝膠及自組裝技術(shù)在Au電極表面聚合了人血清白蛋白，運(yùn)用壓電石英晶體阻抗技術(shù)及電化學(xué)阻抗技術(shù)，以鐵氰化鉀為探針分子，對人血清白蛋白進(jìn)行了定量檢測，檢出限為10 6 mg/mL。
3.2.2 電流型傳感器 電流型分子印跡傳感器是目前電化學(xué)傳感器應(yīng)用最多的類型，以識別前后電流變化作為響應(yīng)信號，既可以直接檢測電活性印跡分子的氧化-還原電流，也能通過底物探針如鐵氰化鉀[63]對非電活性物質(zhì)進(jìn)行間接測定。常規(guī)的電流型分子印跡傳感器靈敏度不高，特別是在大分子如蛋白質(zhì)檢測方面。如何提高傳感器的靈敏度是目前重要的研究方向。納米材料為該問題的解決提供了一個(gè)有力的工具[64]。Wang等[49]在石墨烯改性玻碳電極上修飾離子液體，用電聚合吡咯的方法制備了牛血紅蛋白分子印跡電極(圖5)，用鐵氰化鉀為離子探針，采用DPV法測定目標(biāo)蛋白在電極上印跡前后的電流變化值實(shí)現(xiàn)對BHb的測定，檢出限達(dá)30 pg/L。實(shí)踐證明，納米材料在印跡傳感器信號放大中有廣闊的應(yīng)用前景[65～70]。
3.2.3 電位型傳感器 分子印跡電位型傳感器采用的響應(yīng)信號是分子識別前后電極電位的變化，識別過程中探針或模板分子不需要擴(kuò)散穿過印跡膜，降低了信號響應(yīng)時(shí)間。Wang等[71]通過在Au涂層表面自組裝多羥基硫醇單分子膜建立對肌紅蛋白和血紅蛋白的電位型分子印跡傳感器，傳感器表現(xiàn)出了對目標(biāo)蛋白的優(yōu)異選擇性。Moreira等[72]采用了類似的方法在硅珠表面自組裝有機(jī)硅烷的單分子膜構(gòu)建了肌紅蛋白的電位型傳感器。
3.3 質(zhì)量型傳感器
分子印跡質(zhì)量型傳感器主要包括壓電石英晶體微天平型[73，74](QCM)及表面聲波傳感器型(SAW)。其中較為常用的是QCM型，它是在石英晶體電極表面固定識別元件，通過印跡識別前后振幅、頻率等的變化得到目標(biāo)分子質(zhì)量及濃度信息來達(dá)到檢測目標(biāo)分子的目的。而SAW與QCM的區(qū)別是共振頻率更高，具有更高的靈敏度。Rick等[75]用溶菌酶和細(xì)胞色素C混合蛋白作為模板分子，采用間氨基苯硼酸(APBA)作為功能單體，在過硫酸銨的引發(fā)下，將聚合的印跡物涂覆在QCM金電極表面，通過比較識別前后的頻率變化來對物質(zhì)濃度進(jìn)行檢測。結(jié)論顯示出此聚合物電極具有特異性識別混合蛋白的能力，對模板蛋白的檢出限低至1.39 × 10 9 mol/L(圖6)。Reddy等[76]合成了以牛血紅蛋白和胰島素為模板，采用丙烯酰胺類功能單體，制備了親水型分子印跡水凝膠，利用QCM對目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測。文章同時(shí)考察了四種丙烯酰胺類功能單體的特異性結(jié)合能力，通過計(jì)算印跡膜與非印跡膜的識別位點(diǎn)數(shù)比值α確定在最佳條件下丙烯酰胺功能單體具有最佳的特異性吸附能力。
3.4 在分子成像中的應(yīng)用
分子成像是近年來將分子生物學(xué)與成像技術(shù)相結(jié)合的新領(lǐng)域，它具有可視化、動(dòng)態(tài)采集、全面反映等特點(diǎn)。隨著原子力顯微鏡、分子成像技術(shù)等的逐漸普及和分子造影技術(shù)的長足發(fā)展，分子印跡技術(shù)也逐步用于分子成像可視化分析[77]。此外，分子印跡-分子成像技術(shù)近年來也不再局限于界面表征，Alessandro等[78]用納米二氧化硅作為載體材料，有機(jī)硅烷作為功能單體，利用表面印跡的方法和分子成像技術(shù)對番茄叢矮病毒和蕪菁黃花葉病毒的印跡行為進(jìn)行識別和分析。隨著高分辨率及高通量電子顯微鏡的普及，印跡技術(shù)在分子成像中的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛，病毒、細(xì)菌等生物活體的在線監(jiān)測也將具有良好的研究前景。
4 生物大分子分子印跡傳感器的展望
分子印跡技術(shù)利用仿生原理進(jìn)行分子識別，它具有的高度特異性和對生物活性物的高親和性及良好的穩(wěn)定性都為其在生物大分子的分析應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。隨著生命分析科學(xué)的發(fā)展，大分子印跡技術(shù)將不再局限于蛋白質(zhì)、DNA等的識別檢測，細(xì)胞、細(xì)菌乃至病毒等帶有生命體征的“模板”將會(huì)是分析工作的下一個(gè)重點(diǎn)。其次，新材料的應(yīng)用，例如石墨烯、MOF材料、C60等的應(yīng)用對提高大分子分析檢測的靈敏度和穩(wěn)定性有巨大的潛力。最后，印跡傳感器的微型和便攜化，例如芯片實(shí)驗(yàn)室等，同樣是分析工作的重要領(lǐng)域。傳感器的微型化優(yōu)勢不僅僅表現(xiàn)在野外現(xiàn)場檢測，在大規(guī)模的傳染性疾病的臨床檢測中，同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。
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14 JU Huan-Xian， QIU Zong-Meng， DING Shi-Jia. Bio-Analytical Chemistry. Beijing： Science Press， 2007： 272-290
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