作者：王笑峰 孫迎娟 羅兵 李慧 王云
【關(guān)鍵詞】 HHV6
［摘要］ 目的 探討人皰疹病毒6型(HHV6)和7型（HHV7）感染在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）病因?qū)W中作用。方法 用巢式PCR技術(shù)，檢測62例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人和138例健康獻(xiàn)血員外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）和血漿中HHV6和HHV7 DNA。結(jié)果 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人組PBMCs中HHV6和HHV7 DNA陽性率與正常對照組比較均無顯著性差異（P>0.05）；部分類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血漿中可檢出HHV6和HHV7 DNA，而對照組血漿中則為陰性。結(jié)論 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人中可能存在HHV6或HHV7的活動性感染，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。
［關(guān)鍵詞］ 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕; 皰疹病毒6型，人;皰疹病毒7型，人;巢式聚合酶鏈反應(yīng)
RELATIONSHIP BETWEEN HHV6 AND HHV7 INFECTION AND RHEUMATOID ARTHRITISWANG XIAOFENG, SUN YINGJUAN, LUO BING, et al (Department of Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the role of human herpesvirus 6 and 7 （HHV6, HHV7） infection in the etiology of rheumatoid arthritis （RA）.MethodsHHV6 and HHV7 DNA from the plasma and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were tested with nested PCR in 62 RA patients and 138 matched healthy adult donors. ResultsThe differences of positive rates of HHV6 DNA and HHV7 DNA in PBMCs of the patients were not significant compared with those of the healthy controls (P>0.05); HHV6 and HHV7 & DNA were detected in the plasma of some patients but negative in the plasma of the controls.ConclusionHHV6 and HHV7 DNA are present in the plasma of some RA patients, which suggests that the active infection of HHV6 and HHV7 may be related to the pathogenesis of RA.
［KEY WORDS］rheumatoid arthritis; human herpsvirus 6; human herpsvirus 7; nested polymerase chain reaction
人皰疹病毒6型和7型（HHV6和HHV7）是新近發(fā)現(xiàn)的對T淋巴細(xì)胞具有高度親嗜性的新型皰疹病毒，人群中感染十分普遍。原發(fā)感染多見于6月～2歲嬰幼兒，原發(fā)感染后通常以潛伏形式長期存在于宿主體內(nèi)，在人體免疫力下降或免疫抑制狀態(tài)下可被激活，導(dǎo)致活動性感染。國內(nèi)外學(xué)者對該病毒與人體免疫功能的相互關(guān)系給予了極大關(guān)注。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種原因不明的自身免疫性疾病，通常認(rèn)為是由多種因素誘發(fā)人體自身免疫反應(yīng)而致病。有資料表明，某些病毒感染可促進(jìn)人體自身免疫反應(yīng)而成為自身免疫性疾病的誘發(fā)因素，但有關(guān)HHV6和HHV7感染與自身免疫性疾病關(guān)系的研究報道不多。本文以RA病人和健康人為研究對象，用巢式PCR檢測其外周血細(xì)胞單個核細(xì)胞（PBMCs）和血漿中HHV6 和HHV7 DNA，進(jìn)一步探討HHV6 和 HHV7感染與RA的相關(guān)性。
1 材料與方法
1.1 對象
RA病人62例，為2002年10月～2002年12月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)科、骨科和風(fēng)濕免疫科門診就診及住院病人，均符合1992年美國心臟病協(xié)會修訂的Jones標(biāo)準(zhǔn)。其中男12例，女28例；年齡10～62歲，平均（34.23±14.70）歲。同期選擇性別和年齡與之相應(yīng)的青島市中心血站健康獻(xiàn)血員138例作為對照。
1.2 方法
1.2.1 標(biāo)本處理 抽取受試者靜脈血4 mL, ACD無菌抗凝， 1 200 r/min離心10 min，吸取中間白膜層,酚氯仿異戊醇法常規(guī)提取外周血細(xì)胞DNA，同時分離血漿置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br/> 1.2.2 血漿PCR模板制備 50 μL血漿加50 μL裂解液，煮沸5 min，以8 000 r/min離心5 min，取上清作為PCR 反應(yīng)模板。
1.2.3 PBMCs中HHV6和HHV7 DNA的檢測采用巢式PCR方法。PCR引物設(shè)計及巢式PCR反應(yīng)條件均參照文獻(xiàn) ［1］，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。同時設(shè)立陽性對照和陰性對照，HHV6陽性對照為HHV6標(biāo)
表1 巢式PCR引物序列（略）
取PCR產(chǎn)物10 μL，20 g/L瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L EtBr）中電泳，80 V、1 h，紫外線透射儀下觀察結(jié)果。HHV6外側(cè)PCR擴增產(chǎn)物為287 bp，內(nèi)側(cè)PCR擴增產(chǎn)物為163 bp；HHV7外側(cè)PCR擴增產(chǎn)物為186 bp，內(nèi)側(cè)PCR擴增產(chǎn)物為124 bp。
1.2.4 限制性酶切分析 取HHV6、HHV7內(nèi)側(cè)PCR陽性擴增產(chǎn)物分別用HindⅢ和 EcoRⅠ進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析。酶切產(chǎn)物于120 g/L聚丙烯酰胺凝膠中電泳，80V、90 min，凝膠用EtBr（0.5 mg/L）染色20 min。紫外線透射儀下觀察結(jié)果。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS四格表卡方檢驗。
2 結(jié) 果
2.1 HHV6 DNA檢測RA病人PBMCs中有34例HHV6 DNA陽性，陽性率為54.84%；對照組PBMCs中有73例HHV6 DNA陽性，陽性率為52.90%（見圖1）。兩組 HHV6 DNA陽性檢出率差異無顯著意義（χ2=0.002，P>0.05）。34例PBMCs HHV6陽性RA病人血漿中23例檢測出HHV6 DNA ，陽性率為37.10%，而對照組血漿中未發(fā)現(xiàn)HHV6 DNA陽性者。
2.2 HHV7 DNA檢測
RA病人PBMCs中有38例HHV7 DNA陽性，陽性率為61.29%；對照組PBMCs中有80例HHV6 DNA陽性，陽性率為57.97%（見圖1）。兩組HHV7 DNA陽性檢出率差異無顯著意義
圖1 部分標(biāo)本PBMCs中HHV6、HHV7 DNA 內(nèi)側(cè) PCR檢測結(jié)果
2.3 PCR產(chǎn)物的限制性酶切分析
HHV6內(nèi)側(cè)PCR陽性擴增產(chǎn)物（163 bp），經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切后可觀察到兩種情況，HHV6A酶切產(chǎn)物為 66 bp和97 bp 兩條帶，而HHV6B不被消化仍為163 bp的內(nèi)側(cè)PCR擴增條帶。RA病人組34例HHV6陽性者中，有30例病人為HHV6B型（88.24%），有4例為HHV6A型（11.76%）；73例HHV6陽性正常對照者中HHV6A型占17.81%（13/73），HHV6B型占82.19%（60/73）。RA病人組與正常對照組HHV7內(nèi)側(cè)PCR陽性擴增產(chǎn)物（124 bp）經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ消化后均出現(xiàn)79 bp和54 bp兩條帶，證明為特異性擴增條帶。
3 討 論
HHV6和HHV7是兩種普遍存在的人類皰疹病毒，均屬β皰疹病毒亞科，具有高度的T淋巴細(xì)胞親嗜性，而且兩者具有較高的同源性。HHV6和HHV7原發(fā)感染后在人體內(nèi)長期存在，具有潛伏活動的生物學(xué)特征。根據(jù)HHV6分離毒株抗原性、感染宿主范圍、限制性酶切圖譜及其序列分析，將HHV6分為兩組,即人皰疹病毒6型Ａ組和B組。HHV6的原發(fā)感染主要為HHV6B感染。有研究提示，HHV6和HHV7與自身免疫性疾病的發(fā)生有一定關(guān)系，其中CD4分子是HHV6和HHV7重要的受體，SECCHIERO等［6］研究顯示，HHV7感染CD4+細(xì)胞后，能引起CD4分子下調(diào)。HHV6、HHV7與其他病毒如EBV和HCMV 1期王笑峰,孫迎娟,羅兵，等HHV6和HHV7感染與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性55可共同導(dǎo)致宿主復(fù)合感染、B淋巴細(xì)胞多克隆激活，機體免疫功能異常。近年來的研究顯示，器官移植和免疫抑制病人HHV6和HHV7檢出率明顯高于正常人，表明免疫抑制的病人非常容易感染HHV6和HHV7或?qū)е聺摲牟《炯せ?，HHV6和HHV7的激活又可加重這些疾病的進(jìn)程［3］。RA是一種全身性T細(xì)胞構(gòu)成和功能紊亂導(dǎo)致的以關(guān)節(jié)滑膜損傷為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其誘因是多方面的。大量研究資料表明，RA與病毒感染有關(guān)，EBV感染是RA始動因子，與類風(fēng)濕沉淀素的產(chǎn)生直接相關(guān)，而HHV6、HHV7感染則可反式激活EBV。細(xì)胞因子在RA的發(fā)病機制中亦發(fā)揮著重要的作用，RA病人的血清及關(guān)節(jié)液中可檢測出高水平的IL1和TNFα，IL1是一種促炎細(xì)胞因子，尤其是IL1β為RA關(guān)節(jié)軟骨破壞最重要的一種細(xì)胞因子。TNFα主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，YOCCUM等［4］認(rèn)為在RA活動期或進(jìn)展期，TNF呈高水平分泌，導(dǎo)致一系列臨床癥狀及局部關(guān)節(jié)組織的破壞，慢性期TNFα水平相對較低且穩(wěn)定。SAXNE等［5］認(rèn)為血清中TNFα升高可能提示疾病的活動性或嚴(yán)重性， TNFα與IL1被稱為“姊妹細(xì)胞因子”，共同起到“中心罪犯”的作用。此外，IL1β和TNFα尚能誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子IL6和IL8的產(chǎn)生， 在RA發(fā)病中共同發(fā)揮作用。已有研究證實，HHV6感染可導(dǎo)致PBMC合成IL2降低，誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL1β和TNFα的產(chǎn)生，表明HHV6感染在自身免疫疾病中可直接發(fā)揮作用。研究證實，健康人PBMC中可檢測到HHV6 和HHV7 DNA，且HHV6和HHV7潛伏感染狀態(tài)可被某些影響因素激活，從潛伏感染病人PBMC中可檢出低水平的HHV6和HHV7 DNA［6］。 本研究以RA病人以及健康獻(xiàn)血員為研究對象，采用巢式PCR技術(shù)檢測PBMC中HHV6和HHV7 DNA,提高了檢測的敏感性和特異性，結(jié)果顯示，病人組與對照組HHV6和HHV7陽性率無顯著性差異，提示HHV6和HHV7感染與RA無明顯相關(guān)性，與COOKE等［7］的研究結(jié)果相同。病人體內(nèi)是否存在HHV6和HHV7的復(fù)發(fā)性激活，疾病的發(fā)生發(fā)展是否與HHV6和HHV7再激活有關(guān)，須確定HHV6和HHV7活動性感染檢測指標(biāo)。SECCHIERO等［8］ 研究表明，血漿、血清和體液中游離HHV6和HHV7 DNA的存在標(biāo)志著HHV6和HHV7的活動性感染。本文結(jié)果顯示，部分RA病人血漿中可檢測到HHV 6和HHV7 DNA，而對照組為陰性，提示部分病人體內(nèi)有HHV6和HHV7的活動性感染，其是否與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)還有待進(jìn)一步實驗研究。此外，本研究中只有2例RA病人血漿中同時檢測出HHV6和HHV7 DNA，這可能由于HHV7感染能激活潛伏狀態(tài)的HHV6，而HHV6一旦被激活后有優(yōu)勢增殖現(xiàn)象，反而抑制了HHV7的增殖，從而引起一系列與HHV6有關(guān)的疾病。深入研究病毒間相互激活的過程，更有助于對疾病的病因?qū)W及治療學(xué)的探討。綜上所述，HHV6 和HHV7的活動性感染可能與RA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，HHV6和HHV7活動性感染指標(biāo)的檢測對研究其與疾病的確切關(guān)系具有重要意義。有關(guān)HHV6和HHV7在RA病因?qū)W中的確切作用還有待進(jìn)一步研究證實。
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