有關于醫(yī)學論文的范文特輯
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談姜黃素抗腫瘤的機制
姜黃素(Curcumin)是從姜科(Zingiberaceae)、天南星科(Araceae)一些植物的根莖中提取的一種黃色色素。它是酸性多酚類物質或二酮類化合物(圖1)。姜黃素在傳統(tǒng)藥物起增效劑的作用。醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗氧化、抗癌等作用。姜黃素可以直接抑制腫瘤的增生，也可以通過增加其他抗癌藥物的抗癌效力而抑制腫瘤。姜黃素為什么可以抗癌呢?近年來從分子、細胞和組織水平對姜黃素抗癌作用的機制進行了大量的研究，這些研究發(fā)現(xiàn)：姜黃素可在藥物作用的靶位點、腫瘤細胞的信號傳遞、腫瘤細胞中某些基因、蛋白質的表達及酶活性、腫瘤細胞的增殖、凋亡、血管生成、多藥耐藥性、增強NK細胞殺傷力等方面發(fā)揮抗癌作用。
1 姜黃素進入腫瘤細胞及其對靶位點和信號轉導的作用
姜黃素發(fā)揮作用，首先要進入細胞。姜黃素進入細胞后，能增加藥物的靶位點，調節(jié)細胞內的信號轉導，從而調節(jié)腫瘤細胞的基因、酶和蛋白質表達。
1.1 腫瘤細胞攝取姜黃素
姜黃素能夠通過細胞攝取進入細胞，然后起細胞毒效應的作用。Hsu等用高效液相色譜法(HPLC)測定姜黃素的防擴散機制，定量研究細胞攝取姜黃素的功能。Chang等用HPLC定量測定人乳腺腺癌和導管癌分離出的三種人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435S和MCF-7(MichiganCancer Foundation-7)對姜黃素的攝取，結果發(fā)現(xiàn)：隨著姜黃素劑量的增加，癌細胞攝取姜黃素顯示出劑量依賴性，抑制增殖和促進凋亡與癌細胞攝取姜黃素相關。
1.2 增加藥物作用的靶位點
抗癌藥物通常通過識別腫瘤細胞表面特異性抗原而與之結合，消滅腫瘤細胞。姜黃素可以增加腫瘤細胞表面藥物識別的靶位點，從而增加藥物的抗癌效用。王家智[3]發(fā)現(xiàn)伊立替康和姜黃素兩種藥物聯(lián)合使用對人結腸癌細胞LoVo的抑制作用高于伊立替康單獨使用，其作用機制可能是姜黃素使LoVo細胞拓撲異構酶I的mRNA及蛋白質的表達增加，增加伊立替康對LoVo細胞的作用靶位點。
1.3 調節(jié)腫瘤細胞的信號傳遞
轉化生長因子-/Smad蛋白是細胞信號傳遞的一種，即一旦受體與配體結合形成復合物后便被激活，受體激酶在細胞質內直接磷酸化并激活特殊類型的轉錄因子Smad，進入核內調節(jié)基因表達，促進甲狀旁腺素相關肽(peptide parathyroidhormone-related protein, PTHrP)、轉錄調節(jié)因子(ETwenty-Six-1, ETS-1)等蛋白質表達。姜黃素能抑制腫瘤細胞的轉化生長因子TGF-刺激的PTHrP的分泌，磷酸化的Smad2/3對TGF-信號反應下降，ETS-1蛋白對p-38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase, MAPK)介導的TGF-信號無反應。Wright等[4]用姜黃素處理接種人乳腺癌細胞MDA-MB-231的小鼠，發(fā)現(xiàn)姜黃素阻止TGF-刺激的PTHrP的分泌，并且能阻斷乳腺癌細胞的Smad信號。另一方面，研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠增強Nrf2(核轉錄因子)信號通路而起抑癌作用。Das等實驗研究發(fā)現(xiàn)了姜黃素通過激活Nrf2信號預防癌癥。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素協(xié)同其他化療藥物共同抗腫瘤的機制是通過增加原抗癌藥物的磷脂酰肌醇3-激酶/ 蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinase/protein-serine- threonine kinase, PI3K/AKT)信號通路調控作用而實現(xiàn)的。PI3K/AKT信號通路與細胞凋亡密切相關，腫瘤細胞的PI3K/AKT信號調控往往出現(xiàn)異常而使其有過強的生長增殖能力。表柔比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)均是抗癌藥物，姜黃素聯(lián)合5-FU或表柔比星使用能大大增加其抗癌能力。金萌[6]用HepG2肝癌細胞進行實驗，用MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5diphenyl tetrazolium, 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法]，反轉錄PCR和Western-Blot分別檢測細胞存活率。武博榮用也相同的方法進行實驗，均發(fā)現(xiàn)了姜黃素是5-FU、表柔比星抑制癌細胞生長的增敏劑，姜黃素聯(lián)合5-FU或表柔比星降低了AKT的表達水平，從而對HepG2細胞P13K/AKT信號通路實現(xiàn)調控。武博榮還確定了降低細胞生存率的最有效濃度配比是姜黃素(20 mol/L)聯(lián)合表柔比星(2 mol/m1)。當姜黃素進入腫瘤細胞，完成信號轉導的作用，即可調節(jié)細胞中某些酶活性及蛋白質、基因的表達。
2 調節(jié)腫瘤細胞中某些酶活性、蛋白質、基因的表達
蛋白質是生命活動主要承擔者，而酶是細胞內各種生化反應的催化劑。某些酶或其他蛋白質過度表達，能促進腫瘤細胞快速增殖。姜黃素能夠抑制某些蛋白質的表達及酶的活性、增加抗氧化酶活性等。
2.1 抑制某些蛋白質的表達及酶的活性
組蛋白去甲基JMJD2A、JMJD2B和JMJD2C過表達是大多數(shù)結腸腫瘤生長的重要原因。姜黃素能夠抑制JMJD2酶的活性。Kim等實驗發(fā)現(xiàn)，JMJD2C的表達下調能夠減少HCT-116結腸癌細胞的生長能力。姜黃素作為JMJD2酶的體外抑制劑的衍生物，可降低體內JMJD2酶的活性。李燕通過實驗發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor 1 , HIF-1)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9, MMP-9)的表達及其啟動子的活性，表明姜黃素能阻止某些蛋白質的轉錄過程而抑制該蛋白質的表達，進而抑制腫瘤生長。
藥物代謝酶可以影響機體對藥物的吸收、藥物代謝速度等。姜黃素與某些抗癌藥物聯(lián)合使用，進入體內受到藥物代謝酶代謝轉化的同時，也可調節(jié)或抑制某些藥物代謝酶的表達水平和代謝活性，從而增加治療效果。Liu等在實驗中將小鼠分成正常對照、苯并芘[benzo(a)pyrene, BP, 是一種致癌物]處理、BP+姜黃素處理、BP+白藜蘆醇處理，和BP +姜黃素+白藜蘆醇處理五組。BP單劑量處理后觀察到在小鼠的肺中藥物代謝酶，即細胞色素酶CYP及細胞色素b5酶活性顯著增加。對BP處理過的小鼠施加姜黃素和白藜蘆醇處理，發(fā)現(xiàn)比其他組顯著降低藥物代謝酶活性。Liu等的實驗結果也表明，姜黃素和槲皮素組合能夠顯著減少藥物代謝酶活性，從而起抑癌作用。羰基還原酶1(carbonyl reductase 1, CBR1)能夠還原代謝抗腫瘤藥物如柔紅霉素(Dau NorubicinRubidomycin, DNR)、阿霉素(Doxorubicin, DOX)等，降低抗腫瘤藥物的效力，且CBR1的表達量隨著抗腫瘤藥物劑量的增加而增加。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素是一種CBR1抑制劑，能與CBR1緊密結合。Hintzpeter等[12]通過分子建模發(fā)現(xiàn)姜黃素占據CBR1的輔因子結合位點，抑制CBR1還原裂解能力，結果表明，姜黃素與柔紅霉素共同使用可以減少A549細胞中柔紅霉素的還原裂解，從而增加其在癌組織中的功效。
蛋白激酶(磷酸化酶b激酶, PBK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞分裂旺盛的組織中高表達，在腫瘤細胞中過表達。張生軍體內外實驗結果表明，姜黃素可以結合PBK，并抑制PBK的活性，從而起到抗結直腸癌HCT116細胞增殖的作用。
2.2 增加抗氧化酶活性
核因子-B(nuclear factor-B, NF-B)是一種轉錄因子蛋白家族，對細胞增殖、凋亡和惡性腫瘤有重要作用。活性氧(reactive oxygen species, ROS)是NF-B最重要的調節(jié)因子之一。細胞內活性氧主要受內源性抗氧化防御系統(tǒng)調控。正常細胞中NF-B的活化和信號傳遞被抗氧化酶抑制并進一步誘導抗氧化酶的活性。在腫瘤細胞中代謝活動的增強導致了氧化應激，其進一步增強內源性抗氧化防御系統(tǒng)的損耗，且引起NF-B的活化進而促進轉錄的進行。Das等通過實驗發(fā)現(xiàn)，姜黃素經內源性抗氧化防御系統(tǒng)，增強抗氧化酶活性而調節(jié)NF-B活性和氧化應激，破壞ROS產生的惡性循環(huán)，破壞腫瘤生長的高氧化性微環(huán)境。Das等也發(fā)現(xiàn)姜黃素預防癌癥是通過增加二期抗氧化酶如谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)、NQO1(Quinone oxidoreductase, 醌氧化還原酶)的活性而實現(xiàn)的。Liu等發(fā)現(xiàn)姜黃素和白藜蘆醇或和槲皮素組合使用時，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)、GST等抗氧化酶的活性增加，細胞中ROS水平降低，從而增加抗癌藥物白藜蘆醇和槲皮素的抗腫瘤效力。
2.3 恢復腫瘤抑制基因的功能
腫瘤抑制基因包括Rb基因、p 5 3 基因、p14ARF基因等。腫瘤抑制基因的功能丟失，細胞周期則失去控制，細胞過度增殖，表現(xiàn)出細胞癌性。Das等實驗研究發(fā)現(xiàn)了在T細胞淋巴瘤小鼠肝臟氧化腫瘤微環(huán)境中，姜黃素能夠恢復腫瘤抑制因子p53水平而達到抑癌效果的。王原等實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過對皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞的CDH1基因(編碼E-cadherin)和p14ARF基因的去甲基化作用而抑制SCL-1細胞增殖。當姜黃素調節(jié)腫瘤細胞中某些基因、蛋白質的表達及酶活性后，即可對腫瘤細胞和天然殺傷細胞發(fā)揮作用。
3 姜黃素對腫瘤細胞和天然殺傷細胞的作用
姜黃素可以抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞的凋亡，逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性，增強天然殺傷細胞的作用。
3.1 抑制腫瘤細胞的增殖
正常細胞的分裂與增殖受到嚴格調控，惡性腫瘤細胞的分裂速度加快，生長與增殖失控。姜黃素可以將腫瘤細胞的分裂增殖阻斷在間期的G期，從而抑制腫瘤細胞的增殖。Hsu等實驗研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制結腸直腸癌細胞增殖。張海燕研究發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制宮頸癌細胞增殖具有劑量依賴性。Chang等通過對從人乳腺腺癌和導管癌中分離的三種細胞的研究，也發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制腫瘤細胞增殖。李旭等發(fā)現(xiàn)姜黃素和吉西他濱均可抑制肝癌細胞HepG2增殖，且二者具有協(xié)同作用。邱偉等[18]運用實時定量PCR(qRT-PCR)及Western blotting等方法發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制肝癌HepG2細胞的增殖，可能是通過下調侵襲相關分子MMP-2(基質金屬蛋白酶2)、MMP-9(基質金屬蛋白酶9)及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的表達而起抑制作用的。
3.2 促進腫瘤細胞凋亡
腫瘤細胞中有一系列的癌基因過量表達，其產物可以阻斷腫瘤細胞凋亡，使其對凋亡誘導因子的敏感性降低，能夠逃逸凋亡機制，成為不死細胞。Hsu等用結腸直腸癌細胞做實驗研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡的作用表現(xiàn)出劑量依賴性，促進凋亡似乎與細胞攝取姜黃素相關。范雙娜用流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡，用免疫細胞化學及Western Blot技術檢測細胞內中Bcl-2(B-cell lymphoma-2，B細胞淋巴瘤/白血病-2基因，是一種原癌基因)蛋白表達，結果表明，姜黃素可能通過下調Bcl-2蛋白表達而促進腫瘤細胞凋亡。張海燕通過對姜黃素對SiHa、Caski、HeLa-S3和HeLa229四種宮頸癌細胞核和SiHa小鼠體內移植瘤模型的細胞凋亡作用的研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠促進癌細胞的死亡，但不影響正常宮頸上皮細胞的生存，且其可能是通過非caspase依賴的細胞死亡途徑實現(xiàn)的。Chang等用HPLC定量測定姜黃素對細胞凋亡的活化作用，結果也表明姜黃素激活腫瘤細胞的凋亡程序，且凋亡似乎與癌細胞攝取姜黃素相關。丁志山等用雞胚絨毛尿囊膜模型，用電子顯微鏡及熒光激活細胞分離儀(fluorescence activated cell sorter, FACS)觀察SMMC-7721細胞的凋亡，結果表明20 mmo/L的姜黃素即可誘導SMMC-7721細胞凋亡。
目前有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還可以增加其他抗腫瘤藥物促進腫瘤細胞凋亡的能力，從而提高藥物治療效果。杜琴等[21]實驗中用MTT法檢測細胞增殖，F(xiàn)ACS監(jiān)測細胞凋亡，Hoechst 33258染色觀察細胞形態(tài)變化，比色法測定細胞凋亡核心成員Ceaspase-3、Ceaspase-8、Ceaspase-9酶活性，Western blot法檢測該蛋白酶切割底物DNA修復酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)。結果表明，白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素使用對SMMC-7721肝癌細胞的促凋亡作用比白藜蘆醇單獨使用要強。Sreenivasan等實驗中用中值效應/等效線圖解法和組合指數(shù)值來表征姜黃素與藥物如卡鉑或依托泊苷或長春新堿聯(lián)合使用比藥物單獨使用增加人視網膜母細胞瘤(RB)癌細胞系凋亡的作用效果更強，表明姜黃素增加RB細胞對化療藥物的敏感度，與其他抗腫瘤藥物在促進腫瘤細胞凋亡上具有協(xié)同作用。李旭等采用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素和吉西他濱協(xié)同促進肝癌細胞HepG2凋亡。
劉小紅實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素通過下調胃癌SGC-7901細胞中線粒體膜電位(mitochondrial membranepotential, MMP)誘導胃癌SGC-7901細胞的凋亡，也表明其誘導作用與位于線粒體上的ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP通道)的閉合狀態(tài)有關。
3.3 逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性
多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)是指腫瘤細胞對多種結構不同，作用靶點不同的抗腫瘤藥物同時具有耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以逆轉腫瘤藥物的多藥耐藥性，有效地抑制腫瘤。李燕等用平板克隆形成和細胞周期分析胃癌細胞SGC790l-VCR的多藥耐藥性，用堿性磷酸酶免疫組織化學、反轉錄PCR等技術和Westem blot實驗，檢測SGC7901-VCR細胞中有關蛋白質的表達。結果表明，低劑量姜黃素可以逆轉SGC7901ⅣCR的多藥耐藥性，提高化療藥物長春新堿的抗胃癌作用。
3.4 增強NK細胞殺傷力
NK細胞是一種重要的免疫細胞，作用于腫瘤細胞、病毒感染細胞等靶細胞后啟動其殺傷活力。姜黃素與其他抗癌藥物聯(lián)合使用，能夠通過增加天然殺傷細胞的細胞毒效應而提高原抗癌藥物的治療效果。Halder等[24]通過小鼠模型與人源化的免疫系統(tǒng)，得出姜黃素與-3脂肪酸和抗氧化劑或與RvD1(resolvin D1, 消退素)能顯著增強NK細胞對胰腺導管腺癌(PDAC)細胞的殺傷效果，并且能預防自身被降解。Fiala[25]通過實驗也得出了姜黃素增強NK細胞殺傷作用的結論。姜黃素在抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞的凋亡，逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性，增強天然殺傷細胞的作用之后，即可在組織水平上，抑制腫瘤血管的形成。
4 抑制腫瘤血管生成
腫瘤組織中包含的血管，主要起營養(yǎng)、支持腫瘤細胞的作用。血管內皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)能促進血管生成，抑制內皮細胞的凋亡等。姜黃素可以通過抑制VEGF的表達而抑制腫瘤血管的生成。李劍明等用荷瘤BALB/c鼠動物模型進行實驗，用光學顯微鏡、熒光顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察小鼠體內新生血管的形態(tài)，用異硫氰酸熒光素-葡聚糖示蹤技術觀測血管生成情況。丁志山等建立雞胚絨毛尿囊膜實驗模型，李小江建立肺腺癌A549 SP細胞亞群荷瘤模型和肺腺癌A549 NON-SP細胞亞群荷瘤模型。汪叢叢等觀察姜黃素對肺癌細胞A549血管擬態(tài)生成，結果均表明，姜黃素通過抑制腫瘤血管生成而抑制腫瘤生長。
5 展望
姜黃素的抗腫瘤是近幾年的研究熱點。多數(shù)研究表明，姜黃素具有很好的抗腫瘤作用，能夠多途徑、多方向地抑制腫瘤。關于姜黃素抗腫瘤的實驗中，有的實驗證明姜黃素對正常細胞無毒，但有部分實驗并未證明其對腫瘤細胞的抑制有選擇性。人們對其一些潛在的功能特性及安全性問題還尚未完全了解，故姜黃素的安全性問題還需要進一步的研究。隨著科學技術的發(fā)展，姜黃素的抗腫瘤機制將會被進一步揭示，其安全性問題也能得到進一步解決。姜黃素將可能代替殺傷癌細胞同時對人體具有很大傷害的化療、放射的治療方法。
談宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A 的含量測定
宣痹洗劑是由威靈仙、紅花等藥材經水煎煮制成的復方制劑，具有散寒除濕、活血止痛之功效，臨床用于治療痹癥寒濕閉阻、淤血阻絡證，癥見膝關節(jié)疼痛，局部畏惡風寒、活動不利、蹲起困難，下肢沉重，晨僵，舌淡苔白，脈弦;膝關節(jié)骨關節(jié)炎見上述證候者。紅花為本方臣藥， 是菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，《本草綱目》中記載紅花有活血、潤燥、止痛、散腫、通經之功效，因此備受國內外學者關注。紅花所含成分主要為色素、黃酮類、揮發(fā)油、脂肪酸、酚酸等。其中羥基紅花黃色素A，是紅花活血化瘀有效成分之一，其在1993 年被Meselhy 等人首次分離得到，是紅花黃色素的主要成分，《中國藥典》2010 年版一部規(guī)定以其作為紅花中的代表性活性成分進行含量測定， 多被用于紅花相關制劑質量標準的含測指標。為保證藥品質量，本研究對宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A 的含量測定進行了研究，采用正交設計優(yōu)化了正丁醇萃取的前處理方法，結果表明，該方法簡便、準確、重復性好，可用于該制劑的質量控制。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
1100 型高效液相色譜儀(UV 檢測器，美國Aglient公司);AE-240 型電子天平(瑞士Mettler 公司)。
1.2 試藥
羥基紅花黃色素A 對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111637-200502);宣痹洗劑樣品(批號：121201、121202、121203)由中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院制劑中心提供;甲醇為色譜純，實驗用水為純凈水，其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
采用Waters Symmetry Shiled-RP18(150mm4.6mm，5 m)色譜柱，以0.1%磷酸甲醇-0.1%磷酸(29∶71)為流動相，流速1 mL/min，檢測波長403 nm，柱溫25℃。
2.2 對照品溶液的制備
精密稱取羥基紅花黃色素A 對照品適量，加25%甲醇制成每1 毫升含10.0 g 的溶液，搖勻，即得。
2.3 供試品溶液的制備
精密量取樣品50.0 mL，置分液漏斗中，加水飽和正丁醇60 mL，振搖萃取4 次，每次50 s，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加25%甲醇使溶解并轉移至5 mL 棕色量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.4 正丁醇萃取方法研究
以羥基紅花黃色素A 的含量為指標，采用L9(34)正交設計表，以正丁醇用量、萃取次數(shù)、振搖時間為考察因素進行正交試驗，正交試驗因素水平與結果見表1~3。因素主次關系依次為正丁醇用量萃取次數(shù)振搖時間，其中正丁醇用量對得率的影響極顯著，其次為萃取次數(shù)與振搖時間， 而振搖50 s 與振搖70 s 的萃取效果基本接近，為節(jié)省時間，故選擇50 s 作為振搖時間，因此確定最佳萃取條件為A3B3C2，即正丁醇用量60 mL，萃取4 次，每次振搖50 s。
2.5 陰性樣品溶液的制備
按處方比例與工藝制備不含紅花的陰性樣品，按2.3項下方法制備陰性樣品溶液。在上述色譜條件下，對照品、樣品及陰性樣品的液相色譜圖見圖1。結果表明， 樣品中其他成分對羥基紅花黃色素A 的測定無干擾。
3.方法學考察
3.1 線性關系考察分別精密吸取對照品溶液4、6、8、10、12、14 L，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量X(g)為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=917.17X+0.16，r=0.9997(n=6)。結果表明，羥基紅花黃色素A 進樣量在0.04~0.14 g 范圍內線性關系良好。
3.2 精密度試驗
精密吸取對照品溶液10 L， 連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，RSD 為1.73%，表明儀器精密度良好。
3.3 重復性試驗
精密量取樣品6 份，分別按2.3項下方法，以上述最佳萃取方法制備供試品溶液，并按2.4項下色譜條件進樣20 L，測定峰面積，計算含量。結果羥基紅花黃色素A 的平均含量為0.3757 g/mL，RSD 為2.0%，表明該方法重復性良好。
3.4 穩(wěn)定性試驗
取同一供試品溶液， 分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣20 L，測得峰面積的RSD 為1.8%，結果表明供試品溶液在24 h 內基本穩(wěn)定。
3.5 加樣回收率試驗
精密量取已知含量(0.3757 g/mL)的同批樣品25 mL 共6 份，分別置分液漏斗中，精密加入對照品溶液(10.02 g/mL)各1.0 mL，分別按2.3項下方法，以上述最佳萃取方法制備供試品溶液，按2.4項下色譜條件進樣20 L，計算回收率。
3.6 樣品測定
取不同批次樣品5 份，分別按2.3項下方法，以上述最佳萃取條件制備供試品溶液，按2.4項下色譜條件進樣20 L，以外標法計算得到其中羥基紅花黃色素A 的含量為0.39 g/mL，RSD 為1.5%。
4 討論
羥基紅花黃色素A 是紅花中主要成分之一，具有活血化瘀、通脈止痛等功效?，F(xiàn)代研究表明，羥基紅花黃色素A 可以擴張冠狀動脈、改善心肌缺血，降低血壓，保護脊髓出血/再灌注損傷，具有抗凝、抗血小板聚集和血管再通作用，能有效緩解不穩(wěn)定性心絞痛(UA)、降低纖維蛋白原濃度、清除自由基、控制心絞痛的發(fā)作及向心肌梗死的轉化、抗疲勞及耐缺氧等藥理作用。
目前，羥基紅花黃色素A 的提取、分離以及純化工藝得到了很大的改進，且其在紅花中含量的定量分析方法先進，體內的藥物代謝方式也已明確。且其多項藥理作用雖然已有報道，但仍然是國內外研究的熱點，一方面是其在靶細胞及分子水平的作用機制尚有待于進一步深入探究;另一方面是與其他中藥活性組分的配伍所產生的新療效及其作用機制需要在分子、細胞、整體動物多個層次予以系統(tǒng)揭示。因此，這就需要對不同制劑中羥基紅花黃色素A 的提取、分離、純化等處理手段以及含量測定進行進一步深入的研究。
正交試驗設計和分析方法是目前最常用的工藝優(yōu)化試驗設計和分析方法，是部分因子設計的主要方法。正交試驗以概率論、數(shù)理統(tǒng)計和實踐經驗為基礎，利用標準化正交表安排試驗方案，并對結果進行計算分析，最終迅速找到優(yōu)化方案，是一種高效處理多因素優(yōu)化問題的科學計算方法。正交設計法就是利用正交表處理多因素多水平試驗的一種科學方法。該法能以盡可能少的試驗次數(shù)， 獲得最滿意的試驗結果，篩選出最佳試驗條件， 找出影響試驗結果的主要因素，從而為在醫(yī)藥科學研究中多因素多水平問題提供了科學的、合理的解決途徑，并日益廣泛地應用于中藥研究中。在工藝條件的優(yōu)選工作中具有廣闊的應用前景，只是在用正交設計法探討工藝條件時，受測試指標及所選因素、水平的影響很大，這樣選擇科學合理的測試指標、因素、水平就成了整個實驗的重要步驟，對能否獲得最佳工藝參數(shù)具有重要意義。本研究以宣痹洗劑為載體，以羥基紅花黃色素A含量為考察指標，采用正交試驗優(yōu)化得到正丁醇最佳萃取條件為：正丁醇用量60 mL，萃取次數(shù)4 次，振搖時間50 s， 并測得其中羥基紅花黃色素A 的含量為0.39 g/mL。
在羥基紅花黃色素A 含量測定研究中，參照《中國藥典》2010 年版及相關文獻，對流動相選擇與比例、柱溫、檢測波長等因素進行了考察。因干擾峰的存在，對流動相進行調整，經比較選定0.1%磷酸甲醇-0.1%磷酸(29∶71)為流動相時最佳。羥基紅花黃色素A 是具有單查耳酮苷類結構的化合物， 極性較強，且呈酸性， 在流動相中加入少量磷酸以抑制其離解，可改善其峰形及分離效果。
劉亮等的研究結果表明，振搖時間對萃取效果無顯著性影響，而本研究結果卻發(fā)現(xiàn)振搖時間對萃取效果有顯著影響，這可能是因為振搖時間太短，樣品溶液不能與正丁醇充分混合，從而影響萃取效果所造成。而本研究結果亦顯示振搖時間為50 s 與70 s 時萃取效果接近， 這可能是振搖50 s 時樣品即與正丁醇充分混合，故選擇50 s 作為最佳萃取時間，在節(jié)省時間的同時，達到了最佳萃取效果。
通過預實驗比對發(fā)現(xiàn)， 如未進行正丁醇萃取，宣痹洗劑中其他成分對羥基紅花黃色素A 的干擾明顯，無法進行含量測定，從而進行萃取，而正丁醇萃取宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A 的過程是利用羥基紅花黃色素A 與雜質在水與正丁醇2 種互不相溶的溶劑中的溶解度或分配系數(shù)之間的差異，通過多次分配而實現(xiàn)分離，而羥基紅花黃色素A 在水飽和正丁醇中具有較大溶解度，所以本試驗用水飽和的正丁醇作為純化萃取的溶劑，具有純化效果好，操作簡便，用時短等優(yōu)點。且羥基紅花黃色素A 是具有單查耳酮苷類結構的化合物，其分子結構中具有不穩(wěn)定基團，在提取、分離、純化過程中易發(fā)生氧化、水解、聚合等反應，將使其結構、藥理作用等發(fā)生變化。
宣痹洗劑為北京中醫(yī)藥十病十藥入選項目，臨床效果顯著，但仍缺少相應質量控制標準，尤其是對其中主成分的含量測定方法尚無相關研究，本研究對其中羥基紅花黃色素A 的含量測定方法進行了研究，為該藥的質量控制提供了理論參考。
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