探究溫腎調(diào)經(jīng)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
探究溫腎調(diào)經(jīng)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
溫腎調(diào)經(jīng)顆粒主要由當(dāng)歸、杜仲、菟絲子、肉蓯蓉、茜草等藥物組成,其處方來源于臨床驗(yàn)方,具有溫腎養(yǎng)血,利溫化濁,祛瘀調(diào)經(jīng)之功效,臨床上用于腎陽不足,沖任血虛,濕濁瘀阻所致之月經(jīng)后期,經(jīng)量稀少,甚或經(jīng)閉不通的治療,效果顯著,是我國在多囊卵巢綜合征研究領(lǐng)域惟一進(jìn)入臨床階段研究的中藥制劑。本研究對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了定性和定量研究,制定了肉蓯蓉、菟絲子、茜草的薄層色譜定性鑒別,并建立了制劑中阿魏酸的高效液相色譜含量測定方法。
1.儀器與試藥
島津SCL-10AVP液相色譜儀(日本),SPD-10AVP檢測器,Class-VP工作站,KQ3200DE型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);優(yōu)普超純水機(jī)UP-Ⅱ-10T(成都超純科技有限公司);1/萬及1/10萬電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。溫腎調(diào)經(jīng)顆粒(自制);毛蕊花糖苷對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號1530-200202);菟絲子對照藥材(中國藥品生物制品鑒定所,批號21232-200401);茜草對照藥材(中國藥品生物制品鑒定所,121049-0301);阿魏酸對照品(中國藥品生物制品鑒定所,100834-200701);硅膠G(薄層色譜用,青島海洋化工廠);甲醇為色譜純,水為自制二次重蒸水,其他試劑均為分析純。
2.方法與結(jié)果
2.1定性鑒別
2.1.1肉蓯蓉的薄層色譜鑒別取本品10g,加甲醇50ml,超聲處理30min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)訜o水乙醇1~2ml使溶解,作為供試品溶液。另取麥角甾苷對照品,加乙醇制成每1ml含2.5mg的溶液。另取不含肉蓯蓉的樣品同法制成陰性對照液。照薄層色譜法(《中國藥典》[1]2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn),吸取上述3種溶液各10μl,分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-9%醋酸(20:3:2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5% FeCl3乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性對照溶液無干擾。
2.1.2菟絲子的薄層色譜鑒別取本品5g,加甲醇60ml,超聲處理30min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)訜o水乙醇溶解,濾過,濾液濃縮至1~2ml,作為供試品溶液。另取菟絲子對照藥材1g,研碎,加甲醇20ml,超聲處理30min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)訜o水乙醇溶解,濾過,濾液濃縮至1~2ml,作為對照藥材溶液。再取菟絲子陰性樣品同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn),吸取上述3種溶液各10μl,分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(5:5:3)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視,供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對照溶液無干擾。
2.1.3茜草的薄層鑒別取本品10g,加甲醇50 ml,超聲處理30min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)勇确氯芙?,濾過,濾液濃縮至1~2 ml,作為供試品溶液。另取茜草對照藥材1g,研碎,加甲醇10ml,超聲處理30min,同法制成對照藥材溶液。再取茜草陰性樣品同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn),吸取上述3種溶液各10μl,分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上,以石油醚(60~90℃)-丙酮(4:1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視,供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對照溶液無干擾。
2.2阿魏酸的含量測定
2.2.1色譜條件Kromasil C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇-5%醋酸(20:80);流速為1.0ml/min;檢測波長323nm,柱溫35℃。
2.2.2對照品溶液的制備取阿魏酸對照品適量,精密稱定,置棕色量瓶中,加甲醇:5%醋酸(1:4)的溶液制成每1ml含阿魏酸10μg的溶液,即得。
2.2.3供試品溶液的制備取本品適量,研細(xì),取1.4g ,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加甲醇:5%醋酸(1:4)混合溶液25ml,稱重,超聲處理(功率160W,頻率50kHz)40min,放冷,再稱重,用以上溶劑補(bǔ)充減失的重量,濾過,取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜(0.45μm),即得。
2.2.4陰性對照溶液制備按處方比例稱取除當(dāng)歸和川芎以外的藥材,按制備工藝制成缺當(dāng)歸和川芎的陰性樣品,按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。
2.2.5專屬性試驗(yàn)分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各20μl,注入液相色譜儀,結(jié)果表明,陰性對照品溶液在對照品、供試品溶液相對保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn),本研究方法可行。色譜峰見圖1。
2.2.6 線性范圍考察精密稱取阿魏酸對照品適量,加甲醇:5%醋酸(1:4)混合溶劑制成每1ml含50μg的對照品溶液,分別精密吸取該溶液0.5、1.0、1.5、2.0、4.0ml置10ml量瓶中,用上述溶劑稀釋至刻度,搖勻,分別吸取20μl注入液相色譜儀,按上述色譜條件測定,計(jì)算,以峰面積對濃度回歸,得回歸方程Y=118234X+3026.98 r=0.9999,結(jié)果表明:阿魏酸在2.50~20.00μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.2.7精密度試驗(yàn)精密吸取阿魏酸對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,每次20μl,計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD1.4%,表明本法精密度良好。
2.2.8重復(fù)性試驗(yàn)制備供試品溶液5份,分別進(jìn)樣,每次20μl,測定阿魏酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1205mg/g, RSD 0.56%,結(jié)果表明本法重復(fù)性好。
2.2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)對同一供試品溶液每隔3h進(jìn)樣1次,每次20μl,共4次,依法測定,結(jié)果阿魏酸峰面積RSD 0.41%,表明供試品溶液在9h內(nèi)穩(wěn)定。 A對照品;B 陰性對照;C.供試品
2.2.10加樣回收率試驗(yàn)取已知含量樣品粉末0.7g,精密稱定,精密加入一定量阿魏酸對照品,按照擬定的方法測定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。表1阿魏酸加樣回收率試驗(yàn)(n=5)
2.2.11樣品測定分別取不同批號的樣品1.4g,精密稱定,按供試品溶液制備方法制備供試品溶液,進(jìn)樣20μl,計(jì)算供試品含量,結(jié)果3批溫腎調(diào)經(jīng)顆粒中阿魏酸含量分別為0.1205、0.1221、0.1235 mg/g。
3.討論
肉蓯蓉、菟絲子、茜草為本品中主要的3味藥,本研究參考文獻(xiàn)[2],建立了以上3味藥材的TLC鑒別方法,結(jié)果表明所建立的方法展開系統(tǒng)分離效果好,斑點(diǎn)清晰,專屬性強(qiáng),陰性無干擾。本品為中藥復(fù)方制劑,成分比較復(fù)雜,處方中當(dāng)歸為君藥,故選定其活性成分阿魏酸作為定量檢測指標(biāo),建立了HPLC含量測定方法、方法學(xué)研究表明該法具有簡便、靈敏、重現(xiàn)性好的特點(diǎn),可以用于本品的質(zhì)量控制方法。