摘要探討小鼠胚胎體外發(fā)育過程中,2種激素(孕馬血清促性腺激素PMSG、人絨毛膜促性腺激素HCG)對早期胚胎發(fā)育的影響。取原核期胚胎培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)體系中,確定適合胚胎發(fā)育的最佳體外培養(yǎng)體系;在胚胎培養(yǎng)液中加入不同濃度的激素,觀察激素對體外發(fā)育的影響。試驗發(fā)現(xiàn)含10%胎牛血清的人輸卵管液培養(yǎng)液(HTF)是該試驗條件下小鼠早期胚胎發(fā)育的最佳培養(yǎng)液;在該培養(yǎng)液中添加不同濃度和不同種類的激素后,各發(fā)育階段胚胎的發(fā)育率與未添加激素的對照組相比均有所下降,但未發(fā)現(xiàn)濃度依賴性。由此可認(rèn)為,高濃度的PMSG和HCG對體外培養(yǎng)的胚胎發(fā)育有抑制作用,可降低胚胎發(fā)育到各階段的比例,尤其是顯著降低了囊胚的發(fā)生率。
　　關(guān)鍵詞激素;小鼠胚胎;體外發(fā)育;影響
　　AbstractThe system for mouse embryo culture,and the effects of two different hormone on mouse preimplantation embryos in vitro were explored.One-cell mouse embryos were cultured in different culture media to determine the optima system,and thendifferentconcentrationhormone were added to the medium to observe the effect ofhormone on mouse embryo development in vitro. HTF +10% FBS medium was the best culture system of mouse preimplantation embryod in viting. After hormone of different concentrations and kinds were added to HTF +10% FBS medium,the development rate of different stages embryos declines compared with control group. High concentration hormone could depress development of mouse preimplantation embryos in vitro,and lessens the developmental proportion of different stage embryos,then significant decreased the occurrence of blastocyst.
　　Key wordshormone;mouse preimplantation embryos;development in vitro;effects
　　早期胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)在發(fā)育生物學(xué)、胚胎移植、轉(zhuǎn)基因動物等領(lǐng)域的研究工作中都有很重要的作用[1]。早期胚胎發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,在此過程中,可受到各種激素的影響,激素通過不同途徑來調(diào)控早期胚胎發(fā)育[2,3]。目前,在不孕治療中經(jīng)常使用到各種促排卵激素,在孕婦妊娠期間也經(jīng)常使用一些激素類藥物,有報道,使用不同劑量和不同種類的激素,可能影響到胚胎的質(zhì)量[4-7]。另外,環(huán)境中也存在著多種激素的類似物,這些激素和激素類似物對胚胎發(fā)育的影響研究,目前還缺乏系統(tǒng)性,尤其是較高濃度的激素水平如何影響胚胎的發(fā)育、胚胎發(fā)育與激素的濃度之間是否存在著劑量依存性、同種激素對不同發(fā)育階段的胚胎的影響等,這些都還不十分明了,很有必要進(jìn)行深入的研究。本研究旨在以小鼠為試驗動物模型,在基礎(chǔ)胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中分別加入不同種類和不同濃度的激素,以探討其對鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響機(jī)理。
　　
　　1材料與方法
　　
　　1.1試驗試劑
　　孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)購自寧波第二激素廠,HTF培養(yǎng)液購于美國In-Vitro公司,透明質(zhì)酸酶購自Vitrolife公司,BSA 粉劑購自BovomaX公司,FBS(胎牛血清)購自Gibco公司。胚胎操作液配制:CZB-HEPES(NaCl為478.9mg/100mL,KCl為36.3mg/100mL,KH2PO4為15.9mg/100mL,MgSO4為14.195mg/100mL,NaHCO3為210.0mg/100mL,C6H12O6為100.0mg/100mL,CaCl2·2H2O為25.0mg/100mL,乳酸鈉(60%糖漿)為370mg/100mL,鏈霉素為50mg/100mL,青霉素為60mg/100mL,HEPES為238.0 mg/100mL)。使用時,添加BSA粉劑4mg/mL,過濾除菌,使用前加溫,用于體外胚胎的收集和清洗操作。
　　1.2試驗動物及處理
　　昆明品系性成熟小鼠,6～8周齡,購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,飼養(yǎng)于光照控制(10L∶14D)、恒溫恒濕的飼養(yǎng)室,自由采食飲水。雌鼠于17∶30左右腹腔注射10IU孕馬血清促性腺激素(PMSG),48h后腹腔注射10IU人絨毛膜促性腺激素(HCG),HCG注射后與正常雄鼠按1∶1比例合籠,次日清晨檢查有無陰栓。有陰栓者于注射HCG后14～21h采用頸椎脫臼法處死小鼠。
　　1.3胚胎收集
　　取出輸卵管移入操作液,在體視顯微鏡下找到輸卵管膨大部,劃破輸卵管膨大部使受精卵(云霧狀)游離出來。用槍頭吸出卵團(tuán),移入含透明質(zhì)酸酶的液滴中反復(fù)吹打,鏡下觀察,當(dāng)受精卵游離出來后,用移卵管(自制巴氏管)吸出來移入新液滴內(nèi)清洗3次,備用。
　　1.4試驗分組與胚胎培養(yǎng)
　　1.4.1檢查通過2-細(xì)胞阻滯情況。收集洗凈的胚胎,選擇形態(tài)較好的受精卵分為2組,分別置于HTF+10% FBS和HTF+4mg/mL BSA培養(yǎng)液小滴中。于37℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后觀察2-細(xì)胞發(fā)育情況并做好記錄。
　　1.4.2檢查培養(yǎng)體系。收集洗凈的胚胎,選擇形態(tài)較好的受精卵分為多組,分別置于HTF+10% FBS培養(yǎng)液小滴中。于37℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每 24h觀察1次,并記錄各發(fā)育階段胚胎數(shù)目。
　　1.4.3激素對胚胎發(fā)育的影響。選擇形態(tài)較好的受精卵分為多組,分別置于添加100、50、10IU/mL的HCG和100、50、10IU/mL PMSG的HTF+10%FBS培養(yǎng)液中。于37℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24h觀察發(fā)育情況,并記錄各發(fā)育階段的胚胎個數(shù)。以不添加激素的HTF+10%FBS培養(yǎng)液作為對照組(CK)。
　　2結(jié)果與分析
　　
　　2.1培養(yǎng)液中添加FBS和BSA檢查培養(yǎng)系統(tǒng)突破2-細(xì)胞阻滯效果
　　在試驗體系中,分別在HTF培養(yǎng)液中添加胎牛血清-FBS(10%)和牛血清白蛋白-BSA(4mg/mL),檢查培養(yǎng)系統(tǒng)能否突破小鼠胚胎發(fā)育的2-細(xì)胞阻滯情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):添加FBS和選購的BSA均可以使原核期胚胎突破2-細(xì)胞阻滯,而以添加血清效果較好,在以下的試驗中將選擇HTF添加血清作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液(見表1)。
　　2.2培養(yǎng)體系檢查
　　應(yīng)用HTF+FBS培養(yǎng)原核期胚胎,可以平均獲得2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚的比例分別為80.3%、78.3%、76.0%、75.5%、68.5%,各發(fā)育階段胚胎個數(shù)的具體數(shù)值見表2。
　　2.3小鼠胚胎發(fā)育各階段的顯微攝影
　　培養(yǎng)后每間隔24h,在相差顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育情況,并拍照,各發(fā)育階段胚胎的形態(tài)如圖1所示。各發(fā)育階段胚胎發(fā)育正常,培養(yǎng)系統(tǒng)相對穩(wěn)定。
　　2.4激素對小鼠原核胚胎體外發(fā)育的影響
　　不同濃度的激素對小鼠胚胎體外發(fā)育的影響結(jié)果見表3。由表3可知,添加激素后,各發(fā)育階段胚胎的發(fā)育率與對照組相比均有所下降,原核期胚胎的2-細(xì)胞發(fā)生率與對照組相比有所下降,但未發(fā)現(xiàn)濃度依賴性;添加不同濃度的HCG使4-細(xì)胞胚胎及其后的各階段胚胎發(fā)育下降尤為明顯,并且未發(fā)現(xiàn)發(fā)育到囊胚階段;添加不同濃度的PMSG,囊胚的發(fā)育率與對照組之間也存在著顯著差異;添加HCG似乎可以降低胚胎異常分裂率,而添加PMSG 似乎使異常分裂胚胎的比例升高,具體情況如何還需要深入的研究。
　　
　　3結(jié)論與討論
　　
　　胚胎的早期發(fā)育過程中,很容易受到激素的影響,在輔助生殖實施過程中,往往需要使用激素進(jìn)行超數(shù)排卵處理,激素對早期胚胎的發(fā)育影響研究可以為人類輔助生殖技術(shù)提高成功率提供一定的理論基礎(chǔ)。近年來,隨著動物胚胎工程的發(fā)展,試管動物、轉(zhuǎn)基因動物和體細(xì)胞核移植動物已相繼出現(xiàn),而生產(chǎn)這些動物的一個關(guān)鍵步驟就是胚胎的體外培養(yǎng),獲得穩(wěn)定的體外發(fā)育率是這些技術(shù)廣泛推廣的基礎(chǔ)。
　　試驗發(fā)現(xiàn),應(yīng)用HTF添加10%血清的培養(yǎng)系統(tǒng)可以很好地支持小鼠胚胎體外發(fā)育,使用的系統(tǒng)在多次試驗檢測過程中相對比較穩(wěn)定,幾次試驗培養(yǎng)的原核期(1-細(xì)胞期)胚胎可以在體外發(fā)生分裂,并可以發(fā)育到囊胚階段。
　　昆明品系小鼠早期胚胎體外培養(yǎng)中表現(xiàn)出嚴(yán)重2-細(xì)胞阻滯現(xiàn)象[8],應(yīng)用模擬輸卵管培養(yǎng)液添加血清和血清白蛋白的方式可以突破2-細(xì)胞阻滯,在本研究中進(jìn)口血清突破2-細(xì)胞阻滯的效果要好于選購的BSA。這可能與血清中含有多種促進(jìn)胚胎發(fā)育的細(xì)胞因子有關(guān)[9]。
　　PMSG和HCG這2種激素經(jīng)常被用于動物的超數(shù)排卵。孕馬血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)具有體內(nèi)的FSH和LH的作用,而人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)是模擬體內(nèi)LH的作用,促進(jìn)黃體發(fā)育,FSH和LH二者在體內(nèi)促進(jìn)卵泡發(fā)育、排卵和黃體發(fā)育。HCG由人胎盤和胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成,現(xiàn)已可高度純化,并可由基因重組生成。自1978年首例經(jīng)體外受精胚胎植入創(chuàng)造的Louise Brown誕生后,近10余年來隨著ART技術(shù)的進(jìn)展,HCG的臨床應(yīng)用也日益廣泛,但其在妊娠早期的功能迄今仍未完全明了。雖然HCG對維持黃體功能是必需的,在不孕癥患者誘導(dǎo)排卵出現(xiàn)黃體功能障礙時,重復(fù)給予HCG能有效地支持黃體功能[10],但也有HCG溶解黃體的報道,試驗表明在大鼠、小鼠、兔和羊于胚胎植入前和植入時,給予1次或多次HCG,會導(dǎo)致產(chǎn)生不同程度的胚胎死亡[11]。特別是最近用促性腺激素誘導(dǎo)排卵,在體內(nèi)或體外受精治療不孕癥時,常繼之出現(xiàn)縮短黃體期致胚胎植入失敗、妊娠率降低等現(xiàn)象,其機(jī)理也還很少闡明。在程渭玉等[12]的研究中也表明HCG對胚胎的毒性,且存在時間、劑量依賴關(guān)系。試驗添加不同濃度的HCG使4-細(xì)胞胚胎及其后的各階段胚胎發(fā)育下降尤為明顯,并且未發(fā)現(xiàn)發(fā)育到囊胚階段的胚胎。
　　PMSG在母馬妊娠38~40d時可以檢測出,60d時達(dá)到高峰,而在120d時開始下降,170d時下降到檢測不出的水平;HCG在非孕婦女處于較低水平,在胚胎發(fā)育早期也處于低水平,在妊娠第2周以后顯著增加。近來也有學(xué)者研究認(rèn)為胚胎體外發(fā)育與激素PMSG、HCG存在關(guān)聯(lián)[13],其他激素也可能影響到胚胎的質(zhì)量[14-16]。在輔助生殖和超數(shù)排卵過程中,需要使用高濃度的PMSG和HCG,在血中二者的濃度高于正常值。在培養(yǎng)體系中添加高濃度的PMSG和HCG,調(diào)查其對早期胚胎發(fā)育的影響,研究發(fā)現(xiàn)胚胎暴露在高濃度的PMSG和HCG降低了胚胎體外發(fā)育到各階段的比例,尤其是明顯降低了囊胚的發(fā)生率,而HCG對胚胎體外發(fā)育的影響似乎更大。由于所調(diào)查的樣本還較小,其具體情況和具體機(jī)制等尚需要深入研究,下一步將擴(kuò)大試驗次數(shù)并深入研究多種激素的聯(lián)合作用對胚胎體外早期發(fā)育的影響。
　　
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