生防木霉拮抗黃瓜枯萎病菌的初步研究
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摘要木霉是一種重要的生防菌,對(duì)黃瓜枯萎病菌有很強(qiáng)的拮抗作用,主要作用方式有:競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生、溶菌作用。溫室盆栽試驗(yàn)顯示,木霉可顯著防治黃瓜枯萎病菌。
關(guān)鍵詞木霉;黃瓜枯萎病菌;生防
木霉(Trichoderma spp.)屬真菌界、雙核菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科、真菌屬,是迄今為止研究和應(yīng)用最多的一類生防菌[1]。木霉的生防機(jī)制復(fù)雜,主要包括競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生、溶菌等[2]。研究木霉對(duì)病原菌的作用機(jī)制及防治效果,可以優(yōu)選木霉菌株,從而提高生防效率。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
以病株上分離的黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)為拮抗對(duì)象,土壤中分離的木霉菌株為拮抗菌。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1競(jìng)爭(zhēng)作用。采用對(duì)峙培養(yǎng)法[3],在直徑為9cm的PDA平板一側(cè)接種直徑為5mm的病原真菌菌絲塊,在平板另一側(cè)接種拮抗菌,28℃共培養(yǎng),觀察兩菌的生長(zhǎng)情況。
1.2.2重寄生作用。在PDA培養(yǎng)基中央放置1塊20mm×20 mm無菌蓋玻片,在左側(cè)距蓋玻片40mm處接種木霉,右側(cè)距蓋玻片20mm處接種黃瓜枯萎病菌,28℃恒溫培養(yǎng)。取下蓋玻片,于顯微鏡下觀察菌絲體的作用方式。
1.2.3抗生作用。在裝有100mL PDB的三角瓶中接入直徑5mm的木霉菌塊,28℃、150rpm培養(yǎng)6d,取濾液離心后過0.22μm細(xì)菌濾器。在90mL、45℃的PDA中加入10mL上述濾液,搖勻倒成平板,接種直徑為5mm的黃瓜枯萎病菌菌塊。28℃恒溫培養(yǎng),觀察生長(zhǎng)情況。
1.2.4溶菌作用。將培養(yǎng)4d的木霉發(fā)酵液8 000rpm離心10min。取15mL上清液倒入培養(yǎng)皿中,接入黃瓜枯萎病菌菌塊。淺層培養(yǎng)5d后觀察生長(zhǎng)情況。以高溫滅菌的木霉上清液中培養(yǎng)的病菌菌塊為對(duì)照。
1.2.5盆栽試驗(yàn)。將黃瓜種子經(jīng)70%乙醇消毒1min,2% NaClO消毒5min,55℃溫水浸15~20min,25℃浸泡2~3h,無菌水沖洗3次,25~30℃下催芽1~2d。將黃瓜枯萎病菌接種到麩皮∶玉米粉為3∶1的培養(yǎng)基中,28℃恒溫箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)滿整個(gè)三角瓶。將催芽基本一致的黃瓜苗在木霉菌懸液(約1×108cfu/mL)中浸1h,取出于滅菌濾紙片上干燥1h后,播種于拌有黃瓜枯萎病菌制劑的土壤中。以無菌水浸種處理為對(duì)照。
2結(jié)果與分析
2.1競(jìng)爭(zhēng)作用
平皿對(duì)峙試驗(yàn)顯示,木霉生長(zhǎng)迅速,可快速占據(jù)空間,有很強(qiáng)的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),能有效抑制黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)。
2.2重寄生作用
顯微鏡下觀察到木霉菌絲體纏繞著黃瓜枯萎菌絲生長(zhǎng),并在病菌菌絲上產(chǎn)生大量分枝,產(chǎn)生寄生作用。
2.3抗生作用
在PDA培養(yǎng)基中加入10%的木霉發(fā)酵液后,黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)不旺盛,與對(duì)照有顯著的差異。
2.4溶菌作用
在未滅菌的木霉上清液中培養(yǎng)的黃瓜枯萎菌塊,僅有細(xì)小菌絲的生長(zhǎng),數(shù)量較少;而在滅菌后的上清液中,黃瓜枯萎菌生長(zhǎng)旺盛,形成大塊菌絲團(tuán)。
2.5盆栽防效試驗(yàn)
盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照相比,木霉浸種處理的黃瓜幼苗死亡率為25.0%,顯著低于對(duì)照的66.7%。
3結(jié)論與討論
作為安全而環(huán)境友好的生防因子,木霉在田間的施用可有效地防治作物病害,從而避免大量使用農(nóng)藥導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生、作物農(nóng)藥含量超標(biāo)及環(huán)境污染等問題[4-6]。因此,對(duì)木霉生防機(jī)制深入而全面的研究,將對(duì)綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生重要的推動(dòng)作用。
4參考文獻(xiàn)
[1] 辛雅芬,商金杰,高克詳.拮抗木霉菌的生防機(jī)制研究進(jìn)展[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,33(4):88-91.
[2] HARMAN G,HOWELL C R,VITERBO A,et al.Trichoderma species-opportunistic,avirulent plant symbionts[J].Nature,2004(2):43-56.
[3] 蒲金基,曾會(huì)才.綠色木霉LTR12-1對(duì)黃瓜枯萎病菌防治作用機(jī)制的初步研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,22(4):22-25.
[4] 呂天曉,徐鳳花,李世貴,等.生防木霉菌原生質(zhì)體的制備及再生研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2009(4):130-134.
[5] 莊敬華,陳捷,楊長(zhǎng)成,等.生防木霉菌生物安全性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(4):715-720.
[6] 王勇,王萬立,劉春艷,等.生防木霉菌Tr9701的鑒定及其生物學(xué)特性[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2006,21(1):100-104.
關(guān)鍵詞木霉;黃瓜枯萎病菌;生防
木霉(Trichoderma spp.)屬真菌界、雙核菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科、真菌屬,是迄今為止研究和應(yīng)用最多的一類生防菌[1]。木霉的生防機(jī)制復(fù)雜,主要包括競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生、溶菌等[2]。研究木霉對(duì)病原菌的作用機(jī)制及防治效果,可以優(yōu)選木霉菌株,從而提高生防效率。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
以病株上分離的黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)為拮抗對(duì)象,土壤中分離的木霉菌株為拮抗菌。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1競(jìng)爭(zhēng)作用。采用對(duì)峙培養(yǎng)法[3],在直徑為9cm的PDA平板一側(cè)接種直徑為5mm的病原真菌菌絲塊,在平板另一側(cè)接種拮抗菌,28℃共培養(yǎng),觀察兩菌的生長(zhǎng)情況。
1.2.2重寄生作用。在PDA培養(yǎng)基中央放置1塊20mm×20 mm無菌蓋玻片,在左側(cè)距蓋玻片40mm處接種木霉,右側(cè)距蓋玻片20mm處接種黃瓜枯萎病菌,28℃恒溫培養(yǎng)。取下蓋玻片,于顯微鏡下觀察菌絲體的作用方式。
1.2.3抗生作用。在裝有100mL PDB的三角瓶中接入直徑5mm的木霉菌塊,28℃、150rpm培養(yǎng)6d,取濾液離心后過0.22μm細(xì)菌濾器。在90mL、45℃的PDA中加入10mL上述濾液,搖勻倒成平板,接種直徑為5mm的黃瓜枯萎病菌菌塊。28℃恒溫培養(yǎng),觀察生長(zhǎng)情況。
1.2.4溶菌作用。將培養(yǎng)4d的木霉發(fā)酵液8 000rpm離心10min。取15mL上清液倒入培養(yǎng)皿中,接入黃瓜枯萎病菌菌塊。淺層培養(yǎng)5d后觀察生長(zhǎng)情況。以高溫滅菌的木霉上清液中培養(yǎng)的病菌菌塊為對(duì)照。
1.2.5盆栽試驗(yàn)。將黃瓜種子經(jīng)70%乙醇消毒1min,2% NaClO消毒5min,55℃溫水浸15~20min,25℃浸泡2~3h,無菌水沖洗3次,25~30℃下催芽1~2d。將黃瓜枯萎病菌接種到麩皮∶玉米粉為3∶1的培養(yǎng)基中,28℃恒溫箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)滿整個(gè)三角瓶。將催芽基本一致的黃瓜苗在木霉菌懸液(約1×108cfu/mL)中浸1h,取出于滅菌濾紙片上干燥1h后,播種于拌有黃瓜枯萎病菌制劑的土壤中。以無菌水浸種處理為對(duì)照。
2結(jié)果與分析
2.1競(jìng)爭(zhēng)作用
平皿對(duì)峙試驗(yàn)顯示,木霉生長(zhǎng)迅速,可快速占據(jù)空間,有很強(qiáng)的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),能有效抑制黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)。
2.2重寄生作用
顯微鏡下觀察到木霉菌絲體纏繞著黃瓜枯萎菌絲生長(zhǎng),并在病菌菌絲上產(chǎn)生大量分枝,產(chǎn)生寄生作用。
2.3抗生作用
在PDA培養(yǎng)基中加入10%的木霉發(fā)酵液后,黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)不旺盛,與對(duì)照有顯著的差異。
2.4溶菌作用
在未滅菌的木霉上清液中培養(yǎng)的黃瓜枯萎菌塊,僅有細(xì)小菌絲的生長(zhǎng),數(shù)量較少;而在滅菌后的上清液中,黃瓜枯萎菌生長(zhǎng)旺盛,形成大塊菌絲團(tuán)。
2.5盆栽防效試驗(yàn)
盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照相比,木霉浸種處理的黃瓜幼苗死亡率為25.0%,顯著低于對(duì)照的66.7%。
3結(jié)論與討論
作為安全而環(huán)境友好的生防因子,木霉在田間的施用可有效地防治作物病害,從而避免大量使用農(nóng)藥導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生、作物農(nóng)藥含量超標(biāo)及環(huán)境污染等問題[4-6]。因此,對(duì)木霉生防機(jī)制深入而全面的研究,將對(duì)綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生重要的推動(dòng)作用。
4參考文獻(xiàn)
[1] 辛雅芬,商金杰,高克詳.拮抗木霉菌的生防機(jī)制研究進(jìn)展[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,33(4):88-91.
[2] HARMAN G,HOWELL C R,VITERBO A,et al.Trichoderma species-opportunistic,avirulent plant symbionts[J].Nature,2004(2):43-56.
[3] 蒲金基,曾會(huì)才.綠色木霉LTR12-1對(duì)黃瓜枯萎病菌防治作用機(jī)制的初步研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,22(4):22-25.
[4] 呂天曉,徐鳳花,李世貴,等.生防木霉菌原生質(zhì)體的制備及再生研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2009(4):130-134.
[5] 莊敬華,陳捷,楊長(zhǎng)成,等.生防木霉菌生物安全性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(4):715-720.
[6] 王勇,王萬立,劉春艷,等.生防木霉菌Tr9701的鑒定及其生物學(xué)特性[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2006,21(1):100-104.