大白菜黑斑病是由鏈格孢屬真菌所致的一種常發(fā)性病害，病原菌包括蕓薹鏈格孢(Alternaria brassicae (Berk.) Sacc.)，甘藍(lán)鏈格孢(A. brassicicola)和蘿卜鏈格孢(A. japonica)3個(gè)種，其中秋冬白菜黑斑病一般由蕓薹鏈格孢引起，而春夏白菜黑斑病則主要由甘藍(lán)鏈格孢引起，是一種世界性的重要病害，最早于1836年在甘藍(lán)上發(fā)現(xiàn)，1934年開始有為害大白菜的記錄[1]。大白菜黑斑病主要通過種子傳代形成異地?cái)U(kuò)散和蔓延，危害葉片和整株植物，全生育過程發(fā)病，嚴(yán)重影響白菜產(chǎn)量和質(zhì)量，成為大白菜生產(chǎn)的主要病害之一，尤其在美國、芬蘭、加拿大、中國臺(tái)灣發(fā)生較重[2，3]。我國最早在1919年于廣東省的甘藍(lán)上發(fā)現(xiàn)，1937年江蘇報(bào)道其為害大白菜。20世紀(jì)70年代末，黑斑病在我國大白菜等十字花科蔬菜上逐漸嚴(yán)重起來[4]。

　　大白菜黑斑病主要危害葉片、葉柄及種莢。在真葉上，最初形成圓形退綠斑，病斑擴(kuò)大后轉(zhuǎn)為暗黑色。全株葉片由外向內(nèi)干枯，有明顯較稀的同心輪紋，邊緣有黃色暈環(huán)。潮濕時(shí)病斑有一層黑霉。近年來，隨著春大白菜、早秋大白菜的發(fā)展，黑斑病病害問題日益突出，抗病育種是解決大白菜黑斑病經(jīng)濟(jì)而又有效的途徑，而抗性鑒定則是抗病育種的基礎(chǔ)[5]。

　　國內(nèi)外對(duì)白菜黑斑病的研究主要集中在黑斑病的發(fā)生和危害、寄主植物的抗性、流行病學(xué)因素、病原物生物學(xué)特性和病原物毒素研究及綜合防治等方面[6]。對(duì)于白菜黑斑病，北京市植保所李明遠(yuǎn)[7]進(jìn)行了廣泛深入的研究。1989年樊慕貞等[8]對(duì)河北省白菜黑斑病發(fā)生規(guī)律及防治進(jìn)行了研究。而對(duì)白菜黑斑病鑒定方法的研究目前還比較少見，急需一種快速、簡(jiǎn)便而又精確的抗性鑒定方法，對(duì)我國大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，以期建立簡(jiǎn)單、快速的品種選育流程。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　供試黑斑病菌種(BHB)采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜科技中心試驗(yàn)基地。菌種接種前用PDA碳源減半(馬鈴薯200 g，葡萄糖/蔗糖5 g，瓊脂15 g，pH 7.0，去離子水1 000 mL) 固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

　　供試大白菜品種為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜科技中心提供，分別為品種1、品種2、品種3、品種4、品種5、品種6六種類型大白菜品種。

　　將供試的種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆(8 cm×8 cm)內(nèi)，出苗后每盆留1～3株。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 環(huán)境的選擇 在抗病育種過程中，大田期對(duì)黑斑病進(jìn)行抗性鑒定往往由于氣候條件不適宜發(fā)病而無法進(jìn)行，而苗期在室內(nèi)進(jìn)行鑒定則溫濕度條件較易控制，鑒定周期短、速度快，能節(jié)省大量人力物力。為此，進(jìn)行了室內(nèi)苗期鑒定蘿卜黑斑病抗性的研究，以找出更適于苗期抗病性鑒定的方法，確定苗期黑斑病適宜的誘導(dǎo)發(fā)病條件，并用篩選出的最適方法對(duì)大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行苗期抗病性鑒定和分級(jí)，獲得抗黑斑病材料。

　　1.2.2 影響因素的選擇 為選擇一個(gè)好的抗性鑒定方法，根據(jù)各國學(xué)者在這方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，即選擇從接種物濃度、苗齡、環(huán)境溫度等各方面探討影響大白菜黑斑病抗性鑒定的因素[9]。

　　1.2.3 接種方法的選擇 接種方法包括拌種法、浸種法、土壤接種法、蘸根接種法、根部切傷接種法、噴霧法和針刺法[10]。在確定以接種物濃度、苗齡和溫度這3個(gè)因素為變量的情況下，選擇噴霧法對(duì)大白菜苗進(jìn)行接種。

　　1.3 接種

　　將BHB菌株單孢分離同一時(shí)期的菌體都配制成孢子濃度為1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106個(gè)孢子/mL的懸浮液。

　　當(dāng)大白菜苗長(zhǎng)至3～4片真葉期時(shí)，將每個(gè)品種的1/3再均分成12份，平均分配到(18±1) ℃、(23±1)℃、(28±1)℃ 3個(gè)溫度條件下的光照培養(yǎng)室中適應(yīng)2 d，這2 d里，將培養(yǎng)室的溫度每天上調(diào)1 ℃，之后保持不變[11，12]。將等體積的4個(gè)不同濃度的菌懸液以噴霧法分別接種于同一品種4份大白菜苗上，蓋上保鮮膜保濕24～48 h后揭掉保鮮膜，誘導(dǎo)發(fā)病，接種后于每天早中晚各澆水1次，于接種后第4、7、10、14和18天進(jìn)行病情調(diào)查.

　　當(dāng)剩余的大白菜苗長(zhǎng)至5～6片真葉期時(shí)，再將每個(gè)品種的1/2搬回培養(yǎng)室進(jìn)行同樣的接種處理。待最后剩余的一批大白菜苗長(zhǎng)至7～8片真葉期時(shí)，也對(duì)其進(jìn)行同樣的接種處理。

　　1.4 病情指數(shù)分級(jí)

　　真葉期接種鑒定調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[13]：0級(jí)，無病;1級(jí)，接種葉生褐色小點(diǎn)，無退綠斑;3級(jí)，接種葉生直徑3 mm以下的退綠斑，無霉層;5級(jí)，接種葉生直徑3 mm以上的退綠斑，有極少霉層，病斑不連成片;7級(jí)，接種葉生直徑3 mm以上的退綠斑，有較多的霉層，病斑連成片;9級(jí)，接種葉病斑連成片，大面積枯死，霉層明顯。

　　1.5 抗病性劃分

　　病情分級(jí)調(diào)查后，計(jì)算病情指數(shù)：

　　病情指數(shù)=[Σ(病級(jí)數(shù)×該病級(jí)發(fā)病株數(shù))/(最高發(fā)病級(jí)數(shù)×總調(diào)查株數(shù))]×100[10]。

　　根據(jù)發(fā)病程度進(jìn)行分級(jí)[13]。免疫(I)，病情指數(shù)=0;高抗(HR)，病情指數(shù)=0.10～11.11;抗病(R)，病情指數(shù)=11.12～33.33;中抗(MR)，病情指數(shù)=33.34～55.55;感病(S)，病情指數(shù)=55.56～77.77;高感(HS)，病情指數(shù)=77.78～100。

　　1.6 數(shù)據(jù)處理

　　所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5軟件(LSD，P<0.05)處理，采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行制圖。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 接種天數(shù)對(duì)抗性表現(xiàn)的影響

　　由于在接種后第4天和第7天時(shí)大白菜苗的感病情況不太明顯，而接種后第14天和第18天，多數(shù)大白菜苗因生理原因?qū)е抡昕菟溃瑹o法判斷其發(fā)病情況，因而在這4個(gè)時(shí)期進(jìn)行病情調(diào)查時(shí)所得到的數(shù)據(jù)有殘缺或不準(zhǔn)確，不能代表各個(gè)品種的大白菜苗的感病情況;而在接種后第10天時(shí)，這兩方面的問題相對(duì)而言比較小，調(diào)查所得的數(shù)據(jù)比較全面，這也與嚴(yán)紅等[14]的研究相符。因此，最終選擇用接種后第10天調(diào)查所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖分析。

　　2.2 接種濃度對(duì)抗病性表現(xiàn)的影響

　　從圖1可看出，隨著接種物濃度的增加，其發(fā)病程度也相應(yīng)加強(qiáng)。當(dāng)接種物濃度為1.0×103個(gè)孢子/mL時(shí)，由于其中某些品種的抗性比較強(qiáng)，發(fā)病程度比較輕，而某些品種的抗性較弱，發(fā)病較重，不能進(jìn)行正確的抗性評(píng)價(jià);而當(dāng)接種物濃度為1.0×106個(gè)孢子/mL時(shí)，6個(gè)品種都嚴(yán)重發(fā)病，且基本無差異，也不能進(jìn)行正確的抗性評(píng)價(jià);當(dāng)接種物濃度為1.0×104個(gè)孢子/mL或1.0×105個(gè)孢子/mL時(shí)，植株發(fā)病比較重且有差異，參考柯桂蘭等[9]的研究結(jié)果，可作為評(píng)價(jià)的濃度。

　　2.3 接種苗齡對(duì)抗病性表現(xiàn)的影響

　　從圖2可以看出，隨著苗齡的增大，植株發(fā)病程度有所下降，整體的抗病性在增強(qiáng)。當(dāng)苗齡為5～6片真葉或7～8片真葉時(shí)，植株發(fā)病程度普遍較低且差異不大，不能進(jìn)行正確的評(píng)價(jià);當(dāng)苗齡為3～4片真葉時(shí)，抗病性強(qiáng)的品種與抗病性弱的品種間的差異非常明顯，可作為抗病性鑒定評(píng)價(jià)的苗齡。

　　2.4 接種溫度對(duì)抗病性表現(xiàn)的影響

　　由圖3可以看出，溫度與植株發(fā)病程度呈正相關(guān)。當(dāng)環(huán)境溫度為(20±1)℃時(shí)，多數(shù)品種的發(fā)病程度都比較低，不能進(jìn)行正確的評(píng)價(jià);當(dāng)環(huán)境溫度為(30±1)℃時(shí)，6個(gè)品種發(fā)病程度都比較嚴(yán)重，且品種間的抗性差異與濃度和苗齡不一致，也不能進(jìn)行正確的抗性評(píng)價(jià);當(dāng)環(huán)境溫度為(25±1)℃時(shí)，品種間的發(fā)病程度比較明顯且與濃度和苗齡的一致，參考柯桂蘭等[9]的研究結(jié)果，可作為抗性評(píng)價(jià)的溫度。

　　3 結(jié)論

　　本研究結(jié)果表明，在(25±1) ℃光照培養(yǎng)室內(nèi)，選擇濃度為1.0×104～1.0×105個(gè)孢子/mL的黑斑病病菌孢子懸浮液噴霧接種于苗齡為3～4片真葉的大白菜幼苗，保濕24～48 h，10 d后進(jìn)行病情調(diào)查，可對(duì)大白菜種質(zhì)資源抗黑斑病的級(jí)別進(jìn)行正確評(píng)價(jià)。