進入高中，我們要深入學(xué)習(xí)生物知識，除了必修，還有選修。下面小編整理了選修一知識點總結(jié)，下面請跟小編一起來學(xué)習(xí)下吧!

　　專題一 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用

　　課題一 果酒和果醋的制作

　　1、發(fā)酵：通過微生物技術(shù)的培養(yǎng)來生產(chǎn)大量代謝產(chǎn)物的過程。

　　2、有氧發(fā)酵：醋酸發(fā)酵、谷氨酸發(fā)酵

　　無氧發(fā)酵：酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵

　　3、酵母菌是兼性厭氧菌型微生物真菌

　　酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 、分裂生殖、孢子生殖

　　4、在有氧條件下，酵母菌進行有氧呼吸，大量繁殖。C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O

　　5、在無氧條件下，酵母菌能進行酒精發(fā)酵。C6H12O6→2C2H5OH+2CO2

　　6、20℃左右最適宜酵母菌繁殖，酒精發(fā)酵時一般將溫度控制在18℃-25℃

　　7、在葡萄酒自然發(fā)酵的過程中,起主要作用的是附著在葡萄皮表面的野生型酵母菌。

　　在發(fā)酵過程中,隨著酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進入發(fā)酵液,使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色。

　　在缺氧呈酸性的發(fā)酵液中，酵母菌可以生長繁殖，而絕大多數(shù)其他微生物都因無法適應(yīng)這一環(huán)境而受到制約。

　　8、醋酸菌是單細胞細菌(原核生物),代謝類型是異養(yǎng)需氧型,生殖方式為二分裂。

　　9、當(dāng)氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸;當(dāng)缺少糖源時，醋酸菌將乙醇變?yōu)橐胰?，再將乙醛變?yōu)榇姿帷?C2H5OH+4O2→CH3COOH+6H2O

　　10、控制發(fā)酵條件的作用：

　?、俅姿峋鷮ρ鯕獾暮刻貏e敏感，當(dāng)進行深層發(fā)酵時，即使只是短時間中斷通入氧氣，也會引起醋酸菌死亡。

　?、诖姿峋钸m生長溫度為30～35℃，控制好發(fā)酵溫度，使發(fā)酵時間縮短，又減少雜菌污染的機會。

　　③有兩條途徑生成醋酸：直接氧化和以酒精為底物的氧化。

　　11、實驗流程：挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→果酒(→醋酸發(fā)酵→果醋)

　　12、酒精檢驗：果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可以用重鉻酸鉀來檢驗。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。

　　先在試管中加入發(fā)酵液2mL，再滴入物質(zhì)的量濃度為3mol/L的H2SO43滴，振蕩混勻，最后滴加常溫下飽和的重鉻酸鉀溶液3滴，振蕩試管，觀察顏色。

　　13、充氣口是在醋酸發(fā)酵時連接充氣泵進行充氣用的;排氣口是在酒精發(fā)酵時用來排出二氧化碳的;出料口是用來取樣的。

　　排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身相連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。開口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用該裝置制酒時，應(yīng)該關(guān)閉充氣口;制醋時，應(yīng)該充氣口連接氣泵，輸入氧氣。

　課題二 腐乳的制作

　　1、多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一種絲狀真菌。代謝類型是異養(yǎng)需氧型。生殖方式是孢子生殖。營腐生生活。

　　2、原理：毛霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸;脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸。

　　3、實驗流程：讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制

　　4、釀造腐乳的主要生產(chǎn)工序是將豆腐進行前期發(fā)酵和后期發(fā)酵。

　　前期發(fā)酵的主要作用：

　　(1)、創(chuàng)造條件讓毛霉生長

　　(2)、使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

　　后期發(fā)酵主要是酶與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程。通過各種輔料與酶的緩解作用，生成腐乳的香氣。

　　5、將豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干塊。所用豆腐的含水量為70%左右，水分過多則腐乳不易成形。

　　水分測定方法如下：精確稱取經(jīng)研缽研磨成糊狀的樣品5～10g(精確到0.02mg)，置于已知重量的蒸發(fā)皿中，均勻攤平后，在100～105℃電熱干燥箱內(nèi)干燥4h，取出后置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫后稱重，然后再烘30min，直至所稱重量不變?yōu)橹埂?/p>

　　樣品水分含量(%)計算公式如下：

　　(烘干前容器和樣品質(zhì)量—烘干后容器和樣品質(zhì)量)/烘干前樣品質(zhì)量

　　毛霉的生長：條件：將豆腐塊平放在籠屜內(nèi)，將籠屜中的控制在15～18℃，并保持一定的溫度。

　　來源：(1).來自空氣中的毛霉孢子;

　　(2). 直接接種優(yōu)良毛霉菌種

　　時間：5天

　　加鹽腌制：將長滿毛霉的豆腐塊分層整齊地擺放在瓶中，同時逐層加鹽，隨著層數(shù)的加高而增加鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時間約為8天左右。

　　用鹽腌制時，注意控制鹽的用量：鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長，可能導(dǎo)致豆腐腐敗變質(zhì);鹽的濃度過高會影響腐乳的口味

　　食鹽的作用：

　　(1).抑制微生物的生長，避免腐敗變質(zhì);

　　(2).析出水分，是豆腐變硬，在后期制作過程中不易酥爛;

　　(3).調(diào)味作用，給腐乳以必要的咸味;

　　(4).浸提毛酶菌絲上的蛋白酶。

　　配制鹵湯：鹵湯直接關(guān)系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。

　　酒的作用：(1).防止雜菌污染以防腐;

　　(2).與有機酸結(jié)合形成酯，賦予腐乳風(fēng)味;

　　(3).酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時間的長短有很大關(guān)系，酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長;酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。

　　香辛料的作用：(1).調(diào)味作用;

　　(2).殺菌防腐作用;

　　(3).參與并促進發(fā)酵過程

　　防止雜菌污染：(1)用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈后要用沸水消毒;

　　(2)裝瓶時，操作要迅速小心。整齊地擺放好豆腐、加入鹵湯后，要用膠條將瓶口密封。封瓶時，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染。

　　課題三 制作泡菜

　　制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代謝類型是異養(yǎng)厭氧 型。在無氧條件下，降糖分解為乳酸 。分裂方式是二分裂。

　　反應(yīng)式為：,含抗生素牛奶不能生產(chǎn)酸奶的原因是抗生素殺死乳酸菌。常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產(chǎn)酸奶。

　　亞硝酸鹽為白色粉末，易溶于水，在食品生產(chǎn)中用作食品添加劑。膳食中的亞硝酸鹽一般不會危害人體健康，國家規(guī)定肉制品中不超過30mg/kg，醬腌菜中不超過20mg/kg，嬰兒奶粉中不超過2mg/kg。亞硝酸鹽被吸收后隨尿液排出體外，但在適宜pH 、溫度和一定微生物作用下形成致癌物質(zhì)亞硝胺。

　　一般在腌制 10 天后亞硝酸鹽含量開始降低，故在10天之后食用最好。

　　測定亞硝酸鹽含量的原理是在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，與 N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合形成玫瑰紅色染料，與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)顯色液目測比較，估算泡菜中亞硝酸鹽含量。

　　專題二 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

　　課題一 微生物的實驗室培養(yǎng)

　　培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

　　培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂(是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑)后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。

　　微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)，固體培養(yǎng)基應(yīng)用于微生物的分離和鑒定，半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。

　　按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成，常用于實際工業(yè)生產(chǎn)。

　　按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。

　　培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子等。

　　碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無機碳源;糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

　　氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3-、NH4+(無機氮源)蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有機氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2。

　　培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件。

　　獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：

　?、賹嶒灢僮鞯目臻g、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。

　　②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。

　?、蹫楸苊庵車h(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。

　?、軐嶒灢僮鲿r應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

　　消毒與滅菌的區(qū)別：消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。

　　消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法(對于一些不耐高溫的液體)還有化學(xué)藥劑(如酒精、氯氣、石炭酸等)消毒、紫外線消毒。

　　滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。

　　滅菌方法：

　　①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法;

　?、诓Ａ髅?、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱 ;

　　③培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋 ;

　　④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈 。

　　制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：

　　(1)方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。

　　(2)倒平板操作的步驟：

　　①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

　?、谟沂帜缅F形瓶，將瓶口迅速通過火焰。

　?、塾米笫值哪粗负褪持笇⑴囵B(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

　　④等待平板冷卻凝固，大約需5～10min。然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。

　　倒平板操作的討論

　　1. 培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度?

　　提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。

　　2. 為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰?

　　答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

　　3. 平板冷凝后，為什么要將平板倒置?

　　答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

　　4. 在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎?為什么?

　　答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。

　　純化大腸桿菌：

　　(1)微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

　　(2)平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。

　　(3)稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

　　(4)用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。

　　(5)平板劃線法操作步驟：

　?、賹⒔臃N環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。

　?、谠诨鹧媾岳鋮s接種環(huán)，并打開棉塞。

　?、蹖⒃嚬芸谕ㄟ^火焰。

　?、軐⒁牙鋮s的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。

　　⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。

　?、拮笫謱⒚笊w打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。

　　⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第 一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最 后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。

　　⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　平板劃線操作的討論：

　　1. 為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎?為什么?

　　答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物;

　　每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。

　　劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。

　　2. 在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線?

　　答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

　　3. 在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線?

　　答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

　　(6)涂布平板操作的步驟：

　?、賹⑼坎计鹘谑⒂芯凭臒小?/p>

　?、谌∩倭烤海渭拥脚囵B(yǎng)基表面。

　?、蹖⒄从猩倭烤凭耐坎计髟诨鹧嫔弦迹凭急M后，冷卻8～10s。

　?、苡猛坎计鲗⒕壕鶆虻赝坎荚谂囵B(yǎng)基表面。

　　涂布平板操作的討論：

　　涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作?

　　提示：應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍;等等。

　　菌種的保存：

　　(1)對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。

　?、倥R時保藏方法

　　將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長成后，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。

　　②缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。

　　(2)對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

　　在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的冷凍箱中保存。

　　課題二 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

　　尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶。尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的。

　　篩選菌株：

　　(1)實驗室中微生物的篩選應(yīng)用的原理

　　人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。

　　(2)選擇性培養(yǎng)基

　　在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。

　　(3)配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)

　　根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質(zhì)以達到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物;培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物;加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。

　　統(tǒng)計菌落數(shù)目：

　　(1)測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。

　　(2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理。

　　當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。

　　通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般設(shè)置3～5個平板，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，并取平均值。

　　統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。

　　采用此方法的注意事項：

　　1、一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進行計數(shù)

　　2、為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入TTC

　　3、本法僅限于形成菌落的微生物

　　設(shè)置對照：設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。

　　實驗設(shè)計：實驗設(shè)計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。

　　(1)土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含有機質(zhì)的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。

　　(2)樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計數(shù)的平板。

　　測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用104 105 106

　　測定放線菌的數(shù)量，一般選用103 104 105

　　測定真菌的數(shù)量，一般選用102 103 104

　　(3)微生物的培養(yǎng)與觀察

　　不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌30~37℃，1~2天;放線菌25~28℃，5~7天;霉菌25~28℃，3~4天

　　每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致一樓菌落的數(shù)目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、唯獨及培養(yǎng)時間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。

　　課題三 分解纖維素的微生物的分離

　　纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。

　　纖維素與纖維素酶：

　　(1)棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。

　　(2)纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。

　　纖維素分解菌的篩選：

　　(1)篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應(yīng)直接對微生物進行篩選。

　　(2)剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理：

　　剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。

　　當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

　　分離分解纖維素的微生物的實驗流程：

　　土壤取樣→選擇培養(yǎng)(此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

　　(1)土壤采集 選擇富含纖維素的環(huán)境。

　　(2)剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟 倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板

　　(3)剛果紅染色法種類

　　一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。

　　課題延伸：對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。

　　纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量的測定。

　　專題三 植物的組織培養(yǎng)技術(shù)

　　課題一 菊花的組織培養(yǎng)

　　植物組織培養(yǎng)的基本過程：

　　細胞分化：在生物個體發(fā)育過程中，細胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過程。

　　離體的植物組織或細胞，在培養(yǎng)了一段時間以后，會通過細胞分裂，形成愈傷組織，愈傷組織的細胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細胞。

　　由高度分化的植物組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化，或者叫做去分化。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫做再分化。再分化形成的試管苗，移栽到地里，可以發(fā)育成完整的植物體。

　　植物細胞工程：具有某種生物全套遺傳信息的任何一個活細胞，都具有發(fā)育成完整個體的能力，即每個生物細胞都具有全能性。但在生物體的生長發(fā)育過程中并不表現(xiàn)出來，這是因為在特定的時間和空間條件下，通過基因的選擇性表達，構(gòu)成不同組織和器官。

　　植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用有：實現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖;培育脫毒作物;制作人工種子;培育作物新品種以及細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)等。

　　細胞分化是一種持久性的變化，它的生理意義是：使多細胞生物體中細胞結(jié)構(gòu)和功能趨向?qū)ｉT化，有利于提高各種生理功能的效率。

　　比較根尖分生組織和愈傷組織的異同：

　　影響植物組織培養(yǎng)的條件：

　　材料：不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大。植物材料的選擇直接關(guān)系到試驗的成敗。植物的種類、材料的年齡和保存時間的長短等都會影響實驗結(jié)果。菊花組織培養(yǎng)一般選擇未開花植物的莖上部新萌生的側(cè)枝作材料。

　　一般來說，容易進行無性繁殖的植物容易進行組織培養(yǎng)。選取生長旺盛嫩枝進行組培的是嫩枝生理狀態(tài)好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。

　　營養(yǎng)：離體的植物組織和細胞，對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需要配制適宜的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有機物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。

　　激素：植物激素中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強趨勢。

　　在培養(yǎng)基中需要添加生長素和細胞分裂素等植物激素，其濃度、使用的先后順序、用量的比例等都影響結(jié)果。

　　環(huán)境條件：PH、溫度、光等環(huán)境條件。

　　不同的植物對各種條件的要求往往不同。進行菊花的組織培養(yǎng)，一般將pH控制在5.8左右，溫度控制在18~22℃，并且每日用日光燈照射12h。

　　操作流程：

　　配制MS固體培養(yǎng)基：

　　配制各種母液：將各種成分按配方比例配制成的濃縮液(培養(yǎng)基母液)。

　　使用時根據(jù)母液的濃縮倍數(shù)，計算用量，并加蒸餾水稀釋。

　　配制培養(yǎng)基：應(yīng)加入的物質(zhì)有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機物和植物激素的母液，并用蒸餾水定容到1000毫升。

　　在菊花組織培養(yǎng)中，可以不添加植物激素。

　　原因是菊花莖段組織培養(yǎng)比較容易。

　　滅菌：采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。

　　MS培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用是什么?與肉湯培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基有哪些特點?

　　答：大量元素和微量元素提供植物細胞所必需的無機鹽;蔗糖提供碳源，維持細胞滲透壓;甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。

　　微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)。

　　外植體的消毒：

　　外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。

　　選取菊花莖段時，要取生長旺盛的嫩枝。菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。

　　用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中搖動2~3次，持續(xù)6~7s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗。

　　取出后仍用無菌吸水紙吸干外植體表面水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后，在無菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

　　注意：對外植體進行表面消毒時，就要考慮藥劑的消毒效果，又要考慮植物的耐受能力。

　　接種：接種過程中插入外植體時形態(tài)學(xué)上端朝上，每個錐形瓶接種7～8個外植體。外植體接種與細菌接種相似，操作步驟相同，而且都要求無菌操作。

　　培養(yǎng)：應(yīng)該放在無菌箱中進行，并定期進行消毒，保持適宜的溫度(18~22℃)和光照(12h)。

　　移栽：栽前應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓其在培養(yǎng)間生長幾日，然后用流水清洗根部培養(yǎng)基。然后將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中生活一段時間，進行壯苗。最后進行露天栽培。

　　栽培：外植體在培養(yǎng)過程中可能會被污染，原因有外植體消毒不徹底;培養(yǎng)基滅菌不徹底;接種中被雜菌污染;錐形瓶密封性差等。

　　專題四 月季的花藥培養(yǎng)

　　被子植物的花粉發(fā)育被子植物的雄蕊通常包含花絲、花藥兩部分。花藥為囊狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有許多花粉?；ǚ凼怯苫ǚ勰讣毎?jīng)過減數(shù)分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細胞。

　　被子植物花粉的發(fā)育要經(jīng)歷小孢子四分體時期、單核期和雙核期等階段。在小孢子四分體時期，4個單倍體細胞連在一起，進入單核期時，四分體的4個單倍體細胞彼此分離，形成4個具有單細胞核的花粉粒。

　　這時的細胞含濃厚的原生質(zhì)，核位于細胞的中央(單核居中期)。隨著細胞不斷長大，細胞核由中央移向細胞一側(cè)(單核靠邊期)，并分裂成1個生殖細胞核和1個花粉管細胞核，進而形成兩個細胞，一個是生殖細胞，一個是營養(yǎng)細胞。生殖細胞將在分裂一次，形成兩個精子。

　　注意：①成熟的花粉粒有兩類，一類是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管細胞核和生殖細胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的;另一類是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖細胞就進行一次有絲分裂，形成兩個精子，此花粉粒中含有兩個精子核和一個花粉管核(營養(yǎng)核)

　?、诨ǚ郯l(fā)育過程中的四分體和動物細胞減數(shù)分裂的四分體不同。花粉發(fā)育過程中的四分體是花粉母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的4個連在一起的單倍體細胞;而動物細胞減數(shù)分裂過程中的四分體是聯(lián)會配對后的一對同源染色體，由于含有四條染色單體而稱為四分體。

　　③同一生殖細胞形成的兩個精子，其基因組成完全相同。

　　產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株(即單倍體植株)一般有兩種途徑，一種是花粉通過胚狀體階段發(fā)育為植物，另一種是花粉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再將其誘導(dǎo)分化成植株。

　　這兩種途徑之間并沒有絕對的界限，主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及其濃度配比。

　　注意：①無論哪種產(chǎn)生方式，都要先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根

　　②胚狀體：植物體細胞組織培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)產(chǎn)生的形態(tài)與受精卵發(fā)育成的胚非常類似的結(jié)構(gòu)，其發(fā)育也與受精卵發(fā)育成的胚類似，有胚芽、胚根、胚軸等完整結(jié)構(gòu)，就像一粒種子，又稱為細胞胚。

　　影響花藥培養(yǎng)的因素誘導(dǎo)花粉能否成功及誘導(dǎo)成功率的高低，受多種因素影響，其中材料的選擇與培養(yǎng)基的組成是主要的影響因素。

　　親本的生理狀況：花粉早期是的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株，選擇月季的初花期。

　　合適的花粉發(fā)育時期：一般來說，在單核期，細胞核由中央移向細胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)成功率最高。

　　花蕾：選擇完全未開放的花蕾。

　　親本植株的生長條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種密度等對誘導(dǎo)成功率都有一定影響。

　　材料的選?。哼x擇花藥時，一般要通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。確定花粉發(fā)育時期的最常用的方法是醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細胞核染成藍黑色

　　接種和培養(yǎng)：滅菌后的花蕾，要在無菌條件下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。

　　在剝離花藥時，要盡量不損傷花藥(否則接種后容易從受傷部位長生愈傷組織)，同時還要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成，通常每瓶接種花藥7～10個,培養(yǎng)溫度控制在25℃左右,不需要光照。

　　幼小植株形成后才需要光照。

　　一般經(jīng)過20～30天培養(yǎng)后,會發(fā)現(xiàn)花藥開裂,長出愈傷組織或形成胚狀體。將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進一步分化出再生植株。

　　如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。還需要對培養(yǎng)出來的植株做進一步的鑒定和篩選。

　　植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無菌技術(shù)及接種操作等基本相同。

　　兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時期適宜的花蕾;花藥裂開后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時更換培養(yǎng)基;花藥培養(yǎng)對培養(yǎng)基配方的要求更為嚴(yán)格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。

　　專題五 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)

　　課題一 DNA的粗提取與鑒定

　　提取DNA的溶解性原理包括DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精。

　　DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度的特點：在0.14mol/L時溶解度最小;要使DNA溶解，需要較高濃度?要使DNA析出，又需要0.14mol/L的濃度?

在溶解細胞中的DNA時，人們通常選用2mol/LNaCl溶液;將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精(特別是95%冷卻酒精)，但細胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。

　　從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解;二是降低分子運動，易于形成沉淀析出;三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。

　　采用DNA不溶于酒精的原理，可以達到的目的是：將DNA和蛋白質(zhì)進一步分離。

　　提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應(yīng)選用蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會對DNA產(chǎn)生影響。溫度值為60～80℃，因為該溫度值蛋白質(zhì)變性沉淀，而DNA不會變性。

　　補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術(shù)中DNA變性溫度在95℃。

　　當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時，需要使用什么指示劑進行鑒定?

　　答：在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍色。

　　原理總結(jié)：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細胞中提取和提純DNA;再利用酒精進一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開來，達到提純的目的;最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。

　　實驗材料的選取：

　　不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。

　　本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得;二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。

　　雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。

　　破碎細胞，獲取含DNA的濾液：

　　若選用雞血和洋蔥作實驗材料，則怎樣獲取含DNA的濾液?

　　答：在雞血細胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液;切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。

　　為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂?

　　答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。

　　在以上實驗中，加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么?

　　答：過濾時應(yīng)當(dāng)選用(濾紙、尼龍布)。血細胞在蒸餾水中大量吸水而張裂;洗滌劑瓦解細胞膜;食鹽溶解DNA物質(zhì);選用尼龍布進行過濾。

　　在處理植物組織時需要進行研磨，其目的是什么?研磨不充分產(chǎn)生什么結(jié)果?

　　答：破碎細胞壁，使核物質(zhì)容易溶解在NaCl溶液中;研磨不充分會使DNA的提取量減少，影響實驗結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。具體做法。10mL雞血+20mL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液。

　　為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)?

　　答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

　　最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，需要進一步提純DNA。

　　方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;

　　方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA;

　　方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。

　　方案二與方案三的原理有什么不同?

　　答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開;方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。

　　析出與鑒定：

　　在濾液中仍然含有一些雜質(zhì)，怎樣除去這些雜質(zhì)呢?得到的DNA呈何顏色?

　　答：濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。

　　怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢?

　　答：具體做法：試管2支，編號甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化。

　　實驗操作：

　　制備雞血細胞液：加檸檬酸鈉，靜置或離心

　　↓

　　破碎細胞，釋放DNA：加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌→過濾，除去細胞壁、細胞膜等。

　　↓

　　溶解核內(nèi)DNA：加入NaCl至2mol/L，同一方向緩慢攪拌

　　↓

　　DNA析出：加蒸餾水至0.14mol/L，過濾，在溶解到2mol/L溶液中→除去細胞質(zhì)中的大部分物質(zhì)。

　　↓

　　DNA初步純化：與等體積95%冷卻酒精混合，析出白色絲狀物→除去核蛋白、RNA、多糖等。

　　↓

　　DNA鑒定：二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍色

　　注意事項：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固;雞血靜置或離心以提高細胞懸液濃度;使用塑料燒杯;使用尼龍布過濾;玻棒沿同一方向攪拌;玻棒攪拌要緩慢(細胞破裂快速攪拌);玻棒不要碰到燒杯壁;二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。